Valutazione di una tecnica analitica Accuratezza capacit di

Valutazione di una tecnica analitica • Accuratezza capacità di determinare il valore vero • Precisione capacità di replicare le misure • Limite di rivelabilità concentrazione minima di analita che può essere rivelata • Range dinamico lineare range di concentrazioni in cui la risposta analitica è lineare Segnale • Sensibilità capacità di distinguere due concentrazioni differenti ma molto vicine Concentrazione • Selettività capacità di distinguere tra due analiti • Effetti matrice effetti di altre componenti del campione sulla risposta analitica

Tecniche cromatografiche • In base alla forma del letto cromatografico • Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) • Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) • In base allo stato fisico della fase mobile • Cromatografia Liquida (LC) • Gascromatografia (GC) • Cromatografia fluida supercritica (SFC) • In base al meccanismo di separazione • Adsorbimento • Ripartizione • Scambio ionico • Esclusione • Affinità

Schema delle tecniche Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

Tecniche cromatografiche • analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici Gascromatografia • analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili Cromatografia liquida • analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LC Cromatografia fluida supercritica

Gascromatografia • Gas-liquido • supporto inerte solido • liquido non volatile, legato covalentemente • meccanismo di ripartizione • moltissime applicazioni • Gas-solido • fasi stazionarie di silice, allumina o carbone • meccanismo di adsorbimento • adatta per la separazione di gas permanenti (H 2, He, Ar, O 2, N 2, CO) o idrocarburi a basso punto di ebollizione

Schema di un GC

Colonne per gascromatografia • Colonne impaccate • contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquida • Colonne capillari • WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficie • SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica • PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimento

• Stationary Phases • Must have: • (1) low volatility • (2) thermal stability • (4) chemical inertness • (5) solvation properties giving suitable values for k’, . • Commonest are polysiloxanes: • Nature of R varied to give different polarities. . g. All R = Me : non-polar column. Best for non-polar analytes (hydrocarbons, PAH’s et r R = 50% Me, 50% cyanopropyl - increased polarity - best for alcohols, acids etc. • Greater polarity from polyethylene glycols:

Confronto tra colonne impaccate e capillari Le colonne capillari possono essere lunghe fino a 100 m e hanno quindi un numero di piatti teorici enormemente più elevato rispetto alle colonne impaccate. Questa differenza è esemplificata nella figura a lato (in alto separazione con colonna capillare, in basso la stessa separazione con colonna impaccata)

• Sample Introduction (continued): – A sample can be introduced in several ways, the most common being with a direct insertion probe or by infusion through a capillary column. • Samples are often introduced using a direct insertion probe or a capillary column. • The probe and capillary carry the sample into the vacuum of the mass spectrometer. • Once inside the mass spectrometer, the sample is exposed to the ionization source

• Syringe • Injector • Detector • Gas tank • Column • Oven

Injector • A GC syringe penetrates a septum to inject sample into the vaporization camber • Instant vaporization of the sample, 280 C • Carrier gas transports the sample into the head of the column • Purge valve controls the fraction of sample that enters the column

Splitless (100: 90) vs. Split (100: 1) • Syringe • Injector • He • Purge valve • closed • GC column • Purge valve • open

Split or splitless • Usually operated in split mode unless sample limited • Chromatographic resolution depends upon the width of the sample plug • In splitless mode the purge valve is close for 30 -60 s, which means the sample plug is 3060 seconds • As we will see, refocusing to a more narrow sample plug is possible with temperature programming

Open Tubular Capillary Column • Mobilephase (Helium) flowing at 1 m. L/min • 0. 32 mm ID • Liquid Stationary phase • 0. 1 -5 m • 15 -60 m in length

Oven • Programmable • Isothermal- run at one constant temperature • Temperature programming - Start at low temperature and gradually ramp to higher temperature • More constant peak width • Better sensitivity for components that are retained longer • Much better chromatographic resolution • Peak refocusing at head of column

• General Elution Problem in GC • (a) - low temperature (450 C) - good resolution • initially - but too slow later. • (b) - higher temperature (145 o. C) - much faster faste • but poor resolution for early-eluting species. • In general - best results for temperatures near • boiling point of analyte. • If there is a wide range of boiling points in the • sample - then the best results re obtained by • temperature programming as shown in (c), • for the same mixture, where the temperature • steps are as shown.

Rivelatori per GC • a conducibilità termica (TCD) • a ionizzazione di fiamma (FID) • a cattura di elettroni (ECD) • a conducibilità elettrolitica (ELCD) • amperometrico per lo zolfo (ASD) • termoionico (TID o NPD) • fotometrico a fiamma (FPD) • a fotoionizzazione (PID) • ad emissione atomica (AED) • a chemiluminescenza • spettrometria di massa (MS) Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili. Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto specifici (AED, ASD). Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa Un aspetto da considerare nella scelta del rivelatore è verificare se è distruttivo o no: nel secondo caso può essere interessante mettere in serie più rivelatori (es. TCD e MS)

Rivelatore a conducibilità termica • si misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H 2 ed He • si tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di composto • la sensibilità è una delle peggiori • è un sistema distruttivo non Campione Riferimento

Rivelatore a ionizzazione di fiamma • si misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettrico • è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato) • non risponde a molecole volatili non infiammabili • la sensibilità è buona • è un sistema distruttivo

Rivelatore a cattura di elettroni • si misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti all’uscita della colonna • è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc. ) • la sorgente di elettroni è un beta-emettitore come 3 H o 63 Ni • la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati • è un sistema non distruttivo

Rivelatore a spettrometria di massa • accoppiamento ormai più che consolidato e di straordinaria potenza • è l’unico rivelatore che fornisce informazioni strutturali • è un sistema distruttivo

Scelta del rivelatore La selezione è basata su: • natura chimica degli analiti • potenziali interferenze • limite di rivelabilità richiesto • disponibilità e/o costo

Confronto tra rivelatori Rivelatore Target LOD Range lineare TCD non selettivo 1 ng 106 FID idrocarburi 100 pg 107 ECD alogeni 50 fg Cl 104 ELCD composti di N, S, Cl 1 pg 104 - 106 ASD composti di S 10 ppb S 104 NPD composti di N, P 10 pg 104 FPD composti di S, P 100 pg 103 PID idrocarburi aromatici, eterocomposti 2 pg benzene 107 AED elementi 0. 1 – 20 pg/s 104 Chem composti di N, S 10 pg 104 MS specie 10 ng (SCAN), 10 pg (SIM) 105

Cromatografia liquida

• CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L. C. ) • Scambio ionico • Gel filtrazione • (Size-exclusion chromatography) • Affinità • (Ion exchange chromatography) • (Affinity chromatography) • Separa sulla base delle dimensioni • molecolari • Sulla base di affinità • molecolari • Sulla base della carica netta (+ o -) • Utilizzo nelle fasi tardive di una • purificazione • nelle fasi precoci, ma non solo • La risoluzione dipende: • -dalla lunghezza della colonna • -dalle proprietà della resina • - materiale (silice, gel) • - granulometria • - porosità • - resistenza (rigidità) • - dal volume del campione caricato • La risoluzione dipende: • - dalla “capacità” della • resina (porosità) • - dalla sua affinità • La risoluzione dipende: • - dalla “capacità della resina • (porosità) • - dal p. H dell’eluente • - dal p. I delle proteine da separare • Requisiti da semplici a • Requisiti strumentali da semplici di a Chimica • Requisiti strumentali Laboratorio Analitica Ambientale – a. a. strumentali 2004 -2005 • sofisticati (per caduta, FPLC e sue • sofisticati (per caduta, FPLC, HPLC) • semplici o nessuno

Schema di un HPLC

Selezione della tecnica HPLC

• IL PICCO CROMATOGRAFICO • Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana. • t. R viene misurato nel punto di massimo del picco; • Wb viene ottenuto tracciando le tangenti al punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base • Wh è la larghezza del picco misurata al 50% dell’altezza • Wi è la larghezza del picco misurata ai punti di flesso

• PIATTI TEORICI • Gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi. • La teoria dei piatti considera il sistema cromatografico come un sistema statico in equilibrio. • Ciascun analita stabilisce un equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria. Ciascuno di questi equilibri definisce un piatto teorico • A fase mobile A fase stazionaria • I quattro concetti importanti per capire ed ottimizzare le condizioni separative sono: • k’ Fattore di capacità • Selettività • N Efficienza del sistema (numero di piatti teorici) • R Risoluzione

• EFFICIENZA SEPARATIVA • Il numero dei piatti teorici dipende dalla lunghezza del sistema separativo, per questo è utile ricavare l’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), che generalmente si esprime in millimetri. • L’efficienza è tanto più • lunghezza della colonna in elevata quanto minore mm è H e maggiore è N. • Il concetto di piatto è usato nella distillazione frazionata, dove si considera che ogni stadio di condensazione/evaporazione avvenga su un diverso livello o piatto (questi piatti esistono effettivamente in molte colonne di distillazione) • In cromatografia i piatti sono una rappresentazione teorica degli stadi di ripartizione (distribuzione) che le molecole incontrano durante il loro passaggio nel sistema separativo.

• Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una larghezza della base del picco di 30 s. • Calcolate: • (i) il numero di piatti teorici della colonna; • (ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm • • (i) N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844

• FATTORI INFLUENZANTI L’EFFICIENZA • Quindi l’efficienza separativa è un indice di quanto si riesca ad evitare l’allargamento di banda durante la corsa cromatografica. • Occorre comunque considerare che all’aumentare del tempo di residenza dell’analita nella colonna diventano sempre più importanti i fenomeni di diffusione laterale lungo la colonna stessa e che quindi i picchi che escono a tempi di ritenzione elevati saranno sempre più larghi di quelli che escono prima. • Esistono inoltre allargamenti di banda extra-colonna, dovuti alla diffusione laterale che avviene nei tubi di connessione e nella cella del rivelatore, che devono essere ridotti al minimo mediante un opportuno disegno strumentale.

• Random Elements to Motion • ß Random length of time that each molecule spends in the stationary phase • ß Longitudinal diffusion: solute molecules tend to diffuse from more to less concentrated regions. Therefore some molecules move faster, some move slower than average in direction of flow • • • ß • • Eddy diffusion: if the column is packed with particles of (or supporting) the stationary phase - there are many possibilities for differing routes down the column: • All of these mechanisms have more time to operate, the longer the column. • Hence increased line broadening down the column

LONGITUDINAL DIFFUSION • (MOBILE PHASE) • Longitudinal diffusion in column chromatography is a band • broadening process in which analytes diffuse from the concentrated • center of a band to the more dilute regions ahead of and behind the • band center. Toward and opposed to the direction of flow of the mobile phase. • B is directly proportional to the diffusion coefficient, which is a constant equal • to the rate of migration under a unit concentration gradient. • The diffusion coefficients in liquids are orders of magnitude smaller than those • in gases and therefore the role of the B term plays a small role on the band broadenin • in HPLC

MASS TRANSFER (Adsorption Kinetics) • Stationary phase mass transfer • Mobile phase mass transfer

VAN DEEMTER EQUATION HETP = H = A + B/ + C • A - Multipath effect (Eddy diffusion) • B/ - Longitudinal diffusion • C - Mass transfer term

Increased Efficiency • In any method the object is to increase mobile phase / stationary phase interaction. • Decrease particle size. • Better packing – slower flow.

• FATTORE DI CAPACITA` • Il fattore di capacità di un composto esprime il suo tempo (volume) di ritenzione corretto rispetto al tempo (volume) morto ed è calcolato come segue: • k’ (fattore di capacità) = (t. R - t. M) / t. M = t’R / t. M • Il fattore di capacità è simile ad una costante di equilibrio. Rappresenta la misura del tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria rispetto al tempo di residenza nella fase mobile durante il passaggio attraverso il sistema separativo. Maggiore è il fattore di capacità, più alto è il tempo trascorso in/sopra la fase stazionaria e più tardi il composto eluisce. • Il fattore di capacità è indipendente dalla velocità di flusso e dal sistema in generale. E`una funzione della capacità di ritenzione del sistema separativo accoppiata alle interazioni della fase mobile.

• DIPENDENZA DEL FATTORE DI CAPACITA`

• Column Resolution • A quantitative measure of the ability of a column • to separate two analytes, A and B: • Defined as follows: • Rs = 0. 75 ® incomplete resolution • Rs = 1. 5 ® essentially complete resolution • For Rs = 1. 0, zone A contains 4% B and • vice versa. • Usually compromise between • resolution and speed of analysis • For increased resolution use longer • column - but • (i) longer time & (ii) broader bands

• The General Elution Problem • Mixture of 6 components with very • different partition coefficients • hence very different elution times. • In (a) - optimum for 1 & 2 - excessive • time for 5 & 6. • In (b) optimum for 5 & 6, but 1/2 & 3/4 • not resolved. • Solution - programme the elution so that the conditions start of as in (a), change to • optimum for 3 & 4 (c), then finally as in (b). • This can often give good resolution for a complex mixture in a reasonable time.

Eluizione isocratica o in gradiente isocratica (più forte) isocratica (meno forte) gradiente

• Columns • Usually stainless steel (to withstand pressure), 1 - 5 mm diameter, ~5 m packing. • Very efficient but limited length (cf. GC) because of pressure drop. • Packing - usually silica • Stationary phase - could be involatile liquid (like those in packed-column GC). • More usual now to use similar chemical species actually bonded to the silica • (longer column life), e. g. • R can be non-polar (C 8 or C 18 • hydrocarbon chain) or polar (amine, • nitrile etc. ).

• LA COLONNA CROMATOGRAFICA • Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. • Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe 15 -25 cm, hanno diametro interno di 2 -5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5 -10 m. • Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3 -5 cm e sono riempite con materiali di 3 -5 m. • Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. • Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

• CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO • FASE NORMALE E IN FASE INVERSA • Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: • Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. • Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. • Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

Normal-Phase HPLC • Principle: Adsorption of analytes on the polar, weakly acidic surface of silica gel. • Stationary Phase. : Silica (p. H 2 -8), Alumina (p. H 2 - 12), Bonded Diol, and NH 2 • Mobile Phase: Non-polar solvents (Hexane, CHCl 3) • Applications: Non-polar and semi-polar samples; hexane soluble; positional isomers. • • 30% 47% • • 3% 20% Silica Gel Silica based bonded phases – Diol – Amine – Cyano Alumina Chiral Bonded Phases

Reversed-Phase HPLC • Principle: Partition of analytes between mobile phase and stagnant phase inside the pore space + adsorption on the surface of bonded phase. • Stationary Phase: Hydrophobic surfaces of moieties bonded on silica (C 18, C 5, Phenyl, CN) • Mobile phase: Methanol or Acetonitrile and Water. • Applications: ~80% of all separations done on RP HPLC. • • • 80% Octadecylsilica (ODS, C 18) 10% Octylsilica (C 8) 5% Butylsilica (C 4) 3% Phenyl 2% Cyano (CN)

REVERSED PHASE SEPARATION PRINCIPLE • Nonpolar (nonspecific) interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface (-C 18, C 8, Phenyl, C 4) • Different sorption affinities between analytes results in their separation • More polar analytes retained less • Analytes with larger hydrophobic part are retained longer • Almost no separation of structural isomers • Nonspecific (hydrophobic) interactions are at least ten times weaker than polar • small differences in component molecular structure could have a significant effect in their retention •

Chromatography Stationary Phases • Silica Gel • Derivatized Silica Gel • Where R = C 18 H 37 • hydrocarbon chain • (octadecylsilyl deriv. • silica or “C 18”) • bulk (Si. O 2)x • surface • relatively polar surface • “normal phase” • relatively nonpolar surface • “reversed phase”

• CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO • FASE STAZIONARIA • In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. • In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. • La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). • Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. • Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C 18), usate in fase inversa.

• FASE STAZIONARIA: CHIMICA DELLA SILICE • La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. • La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. • Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata.

• FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE • La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). • FASE STAZIONARIA LIQUIDA • L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata • OH come C 18 o octadecil) e a • OH • Si due piccoli gruppi laterali • Si • OH • Si come il metile. • OH • Si • SUPPORTO SILICEO • Si

• FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE • Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C 18). • OH • O • Si • OH • Si • S • O i • Si • Il grado di ricopertura, espresso in mol/m 2, è una misura della densità di fase sulla superficie della particella.

• DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (ENDCAPPING) • I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di “end-capping” utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto. • OH • O • Si • OH • Si • O • Si

• FASE MOBILE IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA • In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. • Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

• SCELTA DELLA FASE MOBILE • La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: • nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; • nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il p. H e la forza ionica; • nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

• SCELTA DELLA FASE MOBILE • Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC. • Devono infatti possedere queste caratteristiche: • devono essere miscelabili in diverse proporzioni • non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi • non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) • devono avere una bassa viscosità • devono essere poco tossici e poco infiammabili • devono essere non troppo costosi • La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

• LA COLONNA CROMATOGRAFICA • Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. • Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe 15 -25 cm, hanno diametro interno di 2 -5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5 -10 m. • Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3 -5 cm e sono riempite con materiali di 3 -5 m. • Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. • Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

New Technology Monolithic Silica Columns

• Traditional Silica "Particle-Based" Column • Individual silica particles • High flow resistance: Limits ability to shorten run times • High backpressure: Reduces life of pumps, seals, and column • Reduced throughput: Long run times • Bed splitting and voiding possible: Shortens column life and affects reproducibility, lowers efficiency • • Onyx™ “Monolithic” Column • Monolithic porous silica rod • High flow Due to high porosity rates: • Low backpressures: Less stress on system and column • Increased Significantly shorter run times throughput: • No inlet bed settling: Increased reliability, reproducibility, and lifetime, maintains efficiency

Injection • Sample loop filling either done manually or by and autoinjector

The Eluotropic Series

Why use Trifluoroacetic Acid (TFA)? • Good sensitivity detection • Good efficiency • Good recovery • Volatile mobile phase

• ION SUPPRESSION • R-COO- + H+ • Molecola con gruppo carbonilico carico • R-COOH • Molecola polare non carica • ION PAIRING • R-NH 3+ + R-COO • Acido organico aggiunto all’eluente • R-NH 3+ -OOC-R • Coppia ionica

Use of Polar (Acid) Modifiers in Peptide Separations • Aids in peptide solvation • Suppresses ionization • Provides ion pairing • Preferably volatile for sample preparation and LC/MS

Rivelatori per HPLC • Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti • Solute properties: si misura una caratteristica del soluto • Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis) • UV-visibile con Diode-array (UV-DAD) • Spettrofotometrico IR • Fluorimetrico • Indice di rifrazione (RID) • Elettrochimico (ED) • Spettrometria di massa (MS)

Rivelatore spettrofotometrico UV-visibile • il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione) • basato sull’assorbimento di luce nel range UVvisibile • sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm) • sensibilità tipica: 0. 1 ppb • è un sistema distruttivo non

Gruppi cromofori Cromoforo Formula lmax (nm) e aldeide -CHO 210 1. 500 amino -NH 2 195 2. 800 azo -N=N- 285 -400 3 -25 bromuro -Br 208 300 carbossile -COOH 200 -210 50 -70 chetone -C=O 195 1. 000 disolfuro -S-S- 194 5. 500 estere -COOR 205 50 etere -O- 185 1. 000 etilene -C=C- 190 6. 000 fenile -C 6 H 5 202, 255 naftile 220, 275 nitrato -ONO 2 270 12 nitrito -ONO 220 -230 1. 000 -2. 000 nitrile -C=N 160 - nitro -NO 2 210 forte

Scelta della lunghezza d’onda La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni: • massimizzare sensibilità e specificità • il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2 -5 nm) • controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile • i solventi per fase mobile hanno cutoff nell’UV • operando sotto la lcutoff può: • ridurre la sensibilità • introdurre rumore sulla linea di base

Rivelatore Diode-array • misura in ogni istante lo spettro UV-visibile dell’eluato nell’intervallo desiderato • può fornire informazioni strutturali sugli analiti (database di spettri)

Confronto tra rivelatori Rivelatore Target LOD Range lineare UV-visibile/ UV -DAD composti che assorbono luce UV-VIS 1 µg/l 104 Fluorimetrico composti policondensati (PAH) 10 ng/l 103 RID non selettivo 1 mg/l 104 IR 1 mg/l ELSD ED amperometrico composti elettroattivi 100 pg/l ED conducimetrico composti ionici 1 µg/l 103 MS specie 0. 1 µg/l 105

• MULTI-DIMENSIONAL SEPARATIONS: AN ALTERNATIVE TO 2 -D PAGE • In multidimensional chromatography two (or more) techniques with “orthogonal” properties are combined to achieve higher separation power. • MS • FIRST DIMENSION: e. g. Size Exclusion, Ion-Exchange • SECOND DIMENSION: Reversed Phase Exchange e. g. Ion-

• FIRST DIMENSION: SIZE-EXCLUSION CHROMATOGRAPHY • Fraction collected every 30 • 69. 5 sec. • 83. 0 • minutes • SAMPLE: E. coli total protein extract • COLUMN: TSK 3000 SWxl (two)) • MOBILE PHASE: Am. Acetate 200 m. M (water/ACN 87: 13). 0. 25 ml/min

• SECOND DIMENSION: • ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY • FRACTION 69. 5 • FRACTION 83. 0 • SAMPLE: 30 sec. collected after SEC fractions • COLUMN: weak anion exchange TSK-DEAE, NPR 4. 6 x 50 mm • MOBILE PHASE A: Amm. Ac. 0. 025 M MOBILE PHASE B: Amm. Ac. 2 M both in water/ACN 4: 1 • GRADIENT: t 0=20%B, t 10= 20%B, t 20=40%B • minutes

• Colonne (precolonne*, colonne analitiche, le più diverse) • 3. 0 and 4. 6 mm HPLC Columns Standard Super-Link System™ • Rivelatori (Il rivelatore può essere selettivo verso una classe di analiti (es: solo i composti che assorbono nell’UV, solo quelli fluorescenti, ecc) o universale (rivela tutti i componenti). In cromatografia liquida i rivelatori più usati sono: rivelatore UV-vis rivelatore a fluorescenza rivelatore a indice di rifrazione (RI) • * Per rimuovere particolato, saturare la fase mobile con la stazionaria Laboratorio di Chimica Analitica Ambientale – a. a. 2004 -2005 94