Validazione di un metodo di analisi Validazione Validazione

Validazione di un metodo di analisi

Validazione § Validazione di un metodo analitico: § “Conferma attraverso l’esame e l’apporto di evidenza oggettiva che i requisiti particolari per l’utilizzazione prevista siano soddisfatti” (UNI EN ISO 9000: 2000)

Quando validare un metodo? Quando un metodo è § non normato § sviluppato e/o progettato dal laboratorio § normato ma utilizzato al di fuori del proprio scopo e campo di applicazione prefissato § le più comiuni situazioni sperimentali che impongono la validazione sono le seguenti: · un nuovo metodo è sviluppato per scopi particolari; · un metodo analitico normato deve essere aggiornato, migliorato o esteso ad un nuovo problema analitico; · il controllo di qualità evidenzia variazioni temporali dei parametri di qualità; · un metodo stabilito deve essere usato in un diverso laboratorio, da un diverso analista, con diversa strumentazione; · è necessario dimostrare l’equivalenza del metodo in esame con un metodo standard.

Validazione § Il laboratorio che utilizza un metodo deve avere la documentazione che dimostri l’appropriata validazione del metodo stesso. § È responsabilità dell’utilizzatore assicurare che la validazione documentata sia sufficientemente completa

Validazione § Non ci sono linee guida ufficiali per la sequenza degli esperimenti necessari per la validazione § La sequenza ottimale può dipendere dal metodo stesso § E` sempre necessaria la stima dell’incertezza di misura

Parametri che caratterizzano un metodo analitico · Campo di misura · Specificità-selettività analitica · limite di rivelabilità e di quantificazione · range dinamico e lineare · accuratezza intesa come esattezza più precisione (quest’ultima a sua volta distinta in ripetibilità, precisione intermedia e riproducibilità) · incertezza di misurazione · robustezza.

Campo di misura (validità) § Intervallo tra il più alto e il più basso livello dell’analita determinabili con precisione ed accuratezza applicando il metodo stesso § Il campo di misura (validità) è espresso nella stessa unità di misura dell’analita § Dipende dallo scopo del metodo

Specificità-Selettività analitica § Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce una singola risposta § Selettività: si riferisce ad un metodo che produce più risposte (metodo separativo) § ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE L’ANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI

Limite di rilevabilità § È la più bassa concentrazione dell’analita che può essere rilevata, ma non necessariamente determinata quantitativamente, nelle condizioni sperimentali del metodo § Ld. R=3*Sb/S • • • Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni) S =coefficiente angolare della curva di taratura per metodi cromatografici Sb = D/5 dove D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo

Limite di quantizzazione § La Più bassa concentrazione analitica che può essere determinata quantitativamente con accettabile precisione ed esattezza nelle condizioni sperimentali del metodo § Ld. Q = 10*Sb/S • • • Sb = deviazione standard del valore del bianco (almeno 5 campioni) S =coefficiente angolare della curva di taratura per metodi cromatografici Sb = D/5 dove D = differenza tra il valore massimo ed il valore minimo del rumore di fondo

Linearità § La linearità di un metodo analitico è la sua abilità di dare risultati che sono direttamente proporzionali alla concentrazione degli analiti nei campioni all’interno di un determinato campo di validità § la proporzionalità può essere raggiunta anche attraverso trasformazioni matematiche ben definite

Linearità § Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0, 99. § Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o eliminata restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si opera.

Linearità § Si deve effettuare almeno da 3 a 6 repliche di 4 o più concentrazioni § Nella validazione del metodo devono essere riportati il coefficiente di correlazione, la pendenza, l’intercetta e i residui, oltre ad un grafico dei dati sperimentali e della curva calcolata

Esattezza § Grado di concordanza tra il valore medio ottenuto a partire da un grande insieme dì risultati di prova, e un valore dì riferimento accettato

Per la valutazione dell’esattezza: § Confronto con un metodo analitico di ordine metrologico superiore § Analisi di idonei materiali di riferimento certificati a diversi livelli di concentrazione § Confronto con i valori attesi in studi collaborativi (circuiti interlaboratorio) § Analisi di idonei campioni costruiti aggiungendo alla matrice quantità certificate di analita (Spike) a diversi livelli di concentrazione

Ripetibilità § concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenutì con lo stesso metodo su materiali ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica)

Per valutare la ripetibilità si possono usare: § Campioni reali § Materiali di riferimento certificati nella stessa matrice § Materiali di riferimento in matrice ottenuti per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura

Precisione intermedia § Concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su material identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche con possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei materiali di consumo).

Per valutare la Precisione intermedia si possono usare: § Campioni reali § Materiali di riferimento certificati nella stessa matrice § Materiali di riferimento in matrice ottenuti per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura

Riproducibilità § concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, in laboratori diversi, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi

Incertezza di misura § stima legata ad un risultato di prova che caratterizza l'escursione dei valori entro cui si suppone che cada il valore vero del misurando ‑ Ha le dimensioni di uno scarto tipo e si indica con ”U"

valutare l’incertezza può essere riassunto nei seguenti punti: § specificazione del misurando (eseguita nel metodo di prova) § definizione della relazione che lo lega alle grandezze misurate nel metodo di prova (ad esempio modello matematico per la misura della concentrazione specificato nel metodo di prova)

§ identificazione dei fattori che possono contribuire all'Incertezza di misura per ogni stadio del processo eseguito in laboratorio (indicati nel metodo di prova) § raccolta dei dati relativi alle prestazioni del metodo (studi collaborativi, studi di validazione in laboratorio, circuiti inetrlaboratorio)

§ quantificazione dei vari contributi all'incertezza dai dati relativi alle prestazioni del metodo, esprimendole come varianze o scarti tipo (incertezze tipo): u(xi) § combinazione delle incertezze tipo per ottenere l'incertezza composta: uc(y)

§ trasformazione dell'incertezza composta in incertezza estesa U(y) = K uc (y) moltiplicando per il fattore di copertura (K) In generale K=2.

Robustezza § Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali § Variazioni deliberate § % solventi organici § p. H § temperatura § Flusso