DNA SenteziReplikasyon Prof Dr Tlay Akay 1 2

DNA Sentezi(Replikasyon) Prof. Dr. Tülay. Akçay 1

2

Translasyon sonrası işlem 3

Replikasyonda görevli enzimler, kalıba bağımlı polimerazlardır. Yüksek organizmalarda, daha karmaşık olan DNA sentezi, E. Koli ile aynı tip mekanizma ile gerçekleşmektedir. 4

5

DNA Sentezi (Replikasyonu) DNA molekülünün bir zincirinde bulunan (A), karşılığında tamamlayıcı zincirde mutlaka (T) benzer şekilde (G) ile (C) çift oluşturmalı. Bir zincirin dizilimi hakkındaki bilgi, tamamlayıcı zincirde ters yönde yer almaktadır. İki zincir birbirinden ayrıldığında her biri, yeni tamamlayıcı zincir için kalıp olarak hizmet eder. Ana zincirin, iki zincire ayrılarak, her bir zincirin, yeni çiftin bir zincirini oluşturması , semikonservatif replikasyon olarak isimlendirilir . 6

Kromozomal DNA molekülü, hücre döngüsü ile birlikte bir defa replike olmaktadır. Herhangi bir nedenle DNA replikasyonu durursa, hücre bölünmesi de durur. Hücre bölünmesinin çok yavaş olduğu durumlarda ise, DNA replikasyonu zaman içinde aynı miktarda tamamlanmaktadır. DNA sentezi, hücre döngüsünün S fazında meydana gelir. 7

Replikasyonda, DNA polimerazdan başka, herbirinin özel bir görevi olan, 20’den fazla enzim ve proteinler gerekmektedir. Tümüne DNA replikaz sistemi veya replizom denir. 8

DNA Sentezinin Başlaması, Zincir Ayrılması (kol ayrımı) Polimeraz, kalıp olarak sadece tek zincirli DNA molekülünü kullanır DNA molekülünün replikasyon öncesi, zincirlerinin birbirinden tamamen veya küçük bir bölümünün ayrılması gerekmektedir. 9

10

11

DNA replikasyonu; prokaryotlarda replikasyon merkezinde, ökaryotlarda DNA üzerindeki pek çok yerde başlar Böylece, büyük bir ökaryotik DNA molekülünün, kısazamanda replikasyonu sağlanmaktadır. 12

Aktif sentezin başladığı bölgede, dönmeyen iki zincir, birbirinden ayrılarak, replikasyon çatalı’nı oluşturur. DNA molekülü üzerindeki replikasyon çatalı, sentez sırasında merkezden başlayarak ilerler. DNA çift sarmalın replikasyonu, çift yönlü olmaktadır. 13

Özel bir grup protein, replikasyon çatalının ilerlemesini, çift sarmal DNA molekülünün dönmemesi ebeveyin zincirlerin ayrı durmasını sağlar. DNA Helikaz, Heliks Bozucu (HD=Heliks Destabilize) Proteinler, 14

15

Heliks Bozucu (HD) Proteinler Tek zincirli DNA yapısına bağlı protein, (SSB) olarak da isimlendiriler. DNA molekülünün tek zincirine bağlanmaktadır. HD proteinleri , enzim değildirler. Bu proteinlerin DNA’ya bağlanmaları kooperatiftir; bir molekül HD proteini bağlandıktan sonra, Diğer HD proteinlerinin bağlanmaları kolaylaşır. 16

HD Proteinler, Replikasyon merkezinde, iki zinciri birbirinden ayrı tutarlar dönmelerine de mani olarak tek standart kalıp bulunmasını sağlarlar, DNA molekülünü, tek zinciri parçalayan nükleaz enziminin etkisinden de korururlar. 17

18

DNA Helikaz DNA helikaz, çift sarmal DNA zincirlerini birbirinden ATP harcıyarak ayırmaktadır. Replikasyon merkezindeki, ori C olarak tanımlanan kısmındaki 9 baz çiftinin dört kez tekrarlanan bölgesine 20 tane DNA-A proteini, histon benzeri protein(HU) varlığında ve ATP tüketilerek bağlanmaktadır. DNA-A proteini etrafında katlanan DNA, denatüre olur. 19

Bir helikaz olan DNA-B proteini, DNA-C proteini ve ATP gerektiren bir tepkime ile 13 baz çiftinin üç kez tekrarlandığı A=T çiftince zengin bölgeye bağlanır. DNA-B proteini, DNA çift zincirini iki tane replikasyon çatalı olacak şekilde açar. 20

Ayrılmış zincirlere, HD proteinlerinin bağlanması, yeniden çift heliks oluşmasını önler. Zincirlerin birbirlerinden ayrılması sonucu, çift sarmal heliks DNA yapısında oluşan topolojik gerilim, topoizomerazlar tarafından giderilir. 21

Her İki DNA Zinciri, DNA Sentezi İçin Kalıp Olarak Kullanılır Replikasyon çatalında, iki ana zincir ters yönde ilerleyen DNA sentezi için kalıp görevi yapmaktadır. DNA polimeraz ana zincir nükleotid dizisini, sadece 3’ 5’ yönünde okuyabilir yeni DNA zincirini, 5’ 3’ yönünde sentezler. 22

Bir çift ana heliks zincirinden, biri 5’ 3’ yönünde replikasyon çatalına doğru, diğeri ise 5’ 3’ yönünde replikasyon çatalından uzağa doğru ilerleyen iki yeni, düz nükleotid zincir oluşur. Replikasyon çatalına doğru, kesintisiz olarak sentezlenen yeni zincire, öncül zinicir adı verilir. 23

RNA prim er i RNA primeri 24

Replikasyon çatalından uzaklaşarak, aralıklı olarak yapılan sentez sırasında, küçük DNA parçaları replikasyon çatalının yanında sentezlenir. Okazaki parçacıkları deinlen bu küçük parçaların, daha sonra birleşmesi ile tek ve sürekli, artçıl zincirler oluşturulur. 25

Öncü RNA DNA polimerazların, artçıl zincir sentez edebilmeleri için, tek zincirli kalıp üzerinde, DNA zincirinin tamalayıcısı olarak sentezin başlamasını sağlayacak 3’ ucu serbest, kısa bir zincir olan primer gerekir 26

DNA Sentezini yapan asıl enzim DNA polimerazdır Ancak bu enzim iki serbest deoksiribonükleotid arasında bir fosfodiester bağı kuramaz Sentez için, serbest bir 3’ hidroksil ucunu sağlayan molekül primerdir Primer, ribo nükleotidlerden oluşan kısa RNA molekülüdür Artçıl DNA kolunun sentezinde serbest 3’ hidroksil grubu, DNA dan değil, kısa RNA zincirinden sağlanır 27

Primaz (DNA G proteini): S pesifik RNA polimeraz, DNA kalıbına tamamlayıcı ve ters yönde paralel öncül RNA molekülünün, yaklaşık 10 nükleotid uzunluğundaki zincirini, sentezler. Kısa RNA dizisi, artçıl zincir üzerinde, replikasyon çatalında devamlı sentez edilir. 28

Artçıl zincirde, öncü RNA molekülünün sentezinden önce bir araya gelen çeşitli protienler DNA tek zincirine bağlanarak primazla birliktre primozom olarak isimlendirilen, protein kompleksini oluştururlar. DNA-B ve DNA-G primozomun bileşenleridir. 5’ 3’ yönünde hareket eden primozom, periyodik olarak okazaki parçacıklarının sentezini başlatır. 29

Zincir Uzatılması DNA polimeraz III, ilk deoksiribonükleotidin alıcısı olarak, öncü RNA molekülünün , 3’-hidroksil grubunu kullanır. DNA polimeraz III, ana zincire ters yönde paralel, 5’ 3’ yönünde sentezlenen zincirin , nükleotidlerini ekler. 30

Nükleotid zincirinin yapı birimi, 5’deoksiribonükleozid trifosfattır. DNA zincir uzamasında d. ATP, d. TTP, d. CTP ve d. GTP olmak üzere 4 tür deoksiribonükleozid trifosfat kullanılmaktadır. Deoksiribonükleozid trifosfatlardan bir tanesinin eksikliğinde DNA sentezi durur. 31

32

33

Ø Primer , DNA polimeraz için bir nukleotidi ilk kabul edici yer olarak görev yapar. Ø Primer, primaz olarak adlandırılan bir enzim tarafından sentez edilen ve birkaç nukleotidden oluşan bir RNA parçasıdır. DNA kalıbı T C G A G C A 3’ OH Primer T C C G G C C G d. G TP PPi OH

DNA zincirinin büyümesi bloke edilebilinir. Nükleotidin şeker kısmının değiştirilmesi ile elde edilen bazı nükleotid analogları kullanılır DNA replikasyonunun engelleyen bu bileşenler, virus ve hızlı büyüyen hücrelerin bölünmesini yavaşlatırlar. Sitozin arabinozid (ara. C), kanser kemoterapisinde Adenin arabinosid, antiviral tedavide kullanılmaktadır. - 37

Folat girişlerini inhibisyonla (metotoraksat , aminopiterin, trimetoprin) denova sentez ve timidilat sentaz inhibe edilir. 38

DNA nükleotid dizisinin, mümkün olduğunca az hata ile replikasyonu, organizmanın yaşamı için çok önemlidir Zararlı ve belkide öldürücü mutasyonlar kalıp dizisinin yanlış okunması DNA polimeraz III tarafından kontrol edilir. DNA polimeraz III enzimi, 5’ 3’ polimeraz aktivitesine ilaveten, sağlamalı okuma(3’ 5’ ekzonükleaz) 39 aktivitesi de gösterir.

DNA polimeraz III , her bir nükleotidin kalıp üzerindeki tamalayıcı bazına uygun olarak, yeni zincire eklenmesini kontrol eder. Eğer kalıp bazdaki adenine uyan, timin yerine sitozin taşıyan nükleotid yeni zincire eklenirse, DNA polimeraz III, yapıya yanlışlıkla katılan nükleotidi hidrolitik olarak uzaklaştırarak, 40

Öncül RNA molekülünün Çıkartılıp Atılarak DNA ile Yer Değiştirmesi DNA polimeraz III sentezi, yeni bir öncü RNA ile karşılaşıncaya kadar devam eder. Öncü RNA molekülüne gelindiğinde, DNA polimeraz I ile RNA çıkarılarak DNA polimeraz I ile boşluk doldurulur . 41

DNA Polimeraz I’ in aktiviteleri: DNA polimeraz I ‘in DNA sentezini sağlayan 5’ 3’ polimeraz aktivitesi ve polimeraz III de olduğu gibi DNA zincirinin yeni sentezinin doğru okunmasını sağlayan 3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesine ilaveten, 5’ 3’ ekzonükleaz aktivitesine de sahiptir. 42

İlk olarak DNA polimeraz I, DNA polimeraz III tarafından yeni sentezlenen DNA molekülünün 3’ ucu ile komşu öncü RNA molekülünün 5’ ucu arasındaki kırık bölgede yerleşir. 5’ 3’ yönünde hareket eden DNA polimeraz I, RNA nükleotidlerini hidrolitik olarak uzaklaştırarak yerine deoksiribonükleotidleri yerleştirir. DNA molekülünü, 5’ 3’ yönünde polimeraz aktivitesi ile sentezleyen DNA polimeraz I, 3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesini kullanarak yeni zincirin doğru okunmasını sağlar. 43

Uzaklaştırma, sentez ve doğru okuma işlemleri, RNA molekülünün tamamen uzaklaştırılarak boşluğun DNA ile doldurulmasına kadar devam eder. 44

DNA Ligaz DNA polimeraz III tarafından sentezlenen DNA zincirinde, 5’ fosfat grubu ile DNA polimeraz I tarafından sentezlenen DNA’ nın 3’ hidroksil grubu arasındaki son fosfodiester bağının oluşması, DNA ligaz tarafından katalizlenmektedir. DNA molekülünün iki zincirinin birbirine bağlanması için enerji gerekir. Enerji ATP molekülün AMP ve inorganik fosfata parçalanması ile sağlanan 46ır.

3 -Sonlanma safhası Ø E. coli’de DNA’nın iki replikasyon çatalı terminal bölgede birleşir. Ø Bu bölge 20 baz çiftinden oluşur ve Ter. adını alır. Ø Bu bölge aynı zamanda TUS (terminus utilization substance) adlı protein için bağlanma bölgesi içerir ve sentez bu bölgede durur.

Ökaryotik DNA polimerazlar ε α δ β γ Yerleşim nükleer mitokondri Sentez deki fonksiy on Sentezin başlama sı Yeni onarım kolun uzaması DNA polimera z Diğer _ fonksiyo nlar nükleer onarım sentez 3’-5’ _ ekzonükleaz (doğrulama) 3’-5’ ekzonükleaz (doğrulama) 49

Ökaryotik kromozomlar, prokaryotik kromozomlardan farklı olarak doğrusal yapıdadır Kromozomların ucu telomer olarak adlandırılan yapılar ile sonlanır. Normalde sentez sırasında 3‘-OH grubuna nükleotid ilavesi yapılır koromozom ucunda, 3’-OH grubunu sağlayacak pirimer yoktur Bu yüzden her DNA sentezi sonunda, kromozom RNA primeri kadar kısalacaktır Bu problem telomeraz enzimi tarafından giderilir.

TELOMER- TELOMERAZ Kromozom uçlarındaki tekrarlanan nukleotid dizileri TELOMER

TELOMERAZ

53

telomeraz Ribonükleoprotein yapıda, bir revers transkriptaz olup RNA ve protein alt birimlerini içerir Yapısında yer alan RNA alt birimi telomerik tekrarların sentezlenmesinde (TTAGGG) kalıp olarak kullanılır Telomerik tekrar dizilerini artçıl zincirin 3‘ ucuna ilave ederek telomeri uzatır.

Kültür ortamında; Ø İnsan fibroblastının replikasyon sayısı: 50 ± 10 Ø Fare fibroblastının replikasyon sayısı: 15 ± 5 Ø Down sendromlu kişinin fibroblast r. s. : 40 ± 15 (Metabolik hastalıklara sahip -örn. diyabet- ayrıca genetik hastalıklara sahip kişilerde replikasyon sayısı daha düşüktür)

TELOMERİN İŞLEVLERİ DNA daki tek zincirli uçları korumak ve ölümsüzlük Kromozomları yeni düzenlemelerden korumak Mayoz profazında eşleşme ve hareketi sağlamak Kırık kromozomların yapışmasını engellemek

SOMATİK HÜCRELERDE TELOMERLER 1. Hücre kültüründe, Her hücre döngüsü sonunda kısalırlar 2. In vivo da yaşlı kişilerin hücrelerinde daha kısadır 3. Telomerdeki boy kısalması yaşlılık sinyalidir ve belli noktaya kadar kısalma devam eder

Somatik hücrelerde, telomer tekrarları tam olarak doğarlar Ancak bu hücrelerde telomeraz geni kapalıdır Bu nedenle her hücre bölünmesinde telomerin boyu 25 -200 nukleotid kadar kısalır Belli bir noktaya gelindiğinde bölünme durur Bu olay aynı zamanda replikatif hücre yaşlanması olarakta tanımlanır Bu mekanizma somatik hücrelerde, bölünme kontrolü gibi çalışır ve anormal bölünmelere yani kansere karşı korunmayı sağlar

Telomeraz aktivitesi Embriyonik hücrelerde Germ hücrelerinde Sürekli çoğalan hücrelerde (Hematopetik kök hücreleri, aktif lenfositler, intestinal hücreler) Kanser hücrelerinde görülür Normal koşullarda, somatik hücreler telomeraz aktivitesi göstermez. Somatik hücrelerde: Telomer kaybı ve yaşlılık arasında yakın ilişki vardır PROGERIA (Hızlı Yaşlanma Hastalığı), ciddi telomer kısalması ve kaybı gözlenir.

DNA Onarımı

Hasarlı DNA Onarımı DNA sentezi sırasında, sağlamalı okuma ve yanlış yerleşimi onarma olmasına rağmen bazı yanlış yerleşmiş bazlar kalır. İlave olarak, hücrelerde oluşan mutagenler veya inhalasyon veya çevreden absorbe olan mutagenlerle DNA hasara uğratılır. Normal hücreleri, kanser hücrelerine dönüştüren mutagenler, karsinogenler olarak bilinir. 61

Hücrelerin DNA hasarlarını onarabilme yeteneği vardır. Bu onarım mekanizmalarının çoğu, hasarın tanınması, hasarlı kısmın DNA zincirinden uzaklaştırılması ve kalan boşluğun doldurulması gibi işlevleri kapsar. Onarım mekanizması olmaksızın, yaşamamız mümkün olmaz. 62

DNA hasarı, radyasyonla veya kimyasallarla oluşabilir. Bu etkenler direk olarak veya indirek olarak DNA’yı etkiler. Örneğin, x-ray bir tip ionize radyasyondur, hücrede, DNA ile etkileşen molekülleri harekete geçirerek indirek etkiler, bazların yapısını değiştirir veya DNA kollarını kırar. 63

X-ray’a maruz kalmak pek sık olmasada, sigara dumanına maruz kalmaktan kaçınmak daha zordur ve güneş ışığından kaçmak mümkün değildir. Sigara dumanı, aromatik polisiklik hidrokarbon olan, benzo(a)pyrene gibi karsinogenleri kapsar , hücrede enzimlerle okside olduğunda, DNA da guanin ile büyük bir yapı oluşturabilir. Güneşten gelen ultraviole ışığı komşu pirimidin bazların, kovalent dimmer oluşturmasını sağlar 64

Bütün hücreler, çok çeşitli DNA onarım sistemlerine sahiptirler. Onarım sistemlerin çeşit ve sayıları, hücre yaşamı için DNA onarımının önemini ve DNA hasarının çeşitliliğini yansıtır. 65

Prokaryat ve ökaryatlarda benzer olan başlıca 4 tip onarım sistemi vardır 1. Baz kesip çıkarma onarımı 2. Nükleotid kesip çıkarma onarımı 3. Yanlış eşleşme onarımı (mismatch onarım) 4. Direkt onarım 66

Tablo 1: E. koli’de DNA Onarım Sistemleri Enzimler / Proteinler Hasarın Tipi Baz Kesip Çıkarma Onarımı DNA glikozilazlar AP endonükleazlar DNA polimeraz I DNA ligaz Anormal bazlar (urasil, hipoksantin, ksantin): alkalilendirilmiş bazlar; pirimidin dimerleri Nükleotid Kesip Çıkarma Onarımı Uvr. ABC endonükleaz (veya ABC excinuclease) DNA Helikaz DNA polimeraz I DNA ligaz Yapısal değişikliklere neden olan DNA hasarları (örnek: pirimidin dimerleri) 67

Tablo 1: E. koli’de DNA Onarım Sistemleri (devamı) Enzimler / Proteinler Hasarın Tipi Yanlış Eşleşme Onarımı Mut proteinler Helikazlar Ekzonükleazlar DNA polimeraz III DNA ligaz Yeni sentezlenen kollarda yanlış eşleşmiş bazlar. Direkt Onarım DNA fotoliyazlar O 6 -Metilguanin-DNA metitransferaz Pirimidin dimerleri, O 6 -Metilguanin 68

Baz Kesip Çıkarma Onarımı Urasili oluşturmak üzere , amino grubunun uzaklaştırıldığı, sitozin örneğinde olduğu gibi, DNA molekülündeki bazlar, kendiliğinden veya alkillendiren ve deanimasyon yapan bileşiklerin etkisi ile değişebilmektedir. Nitrozaminler, nitritler ve nitratlar gibi öncül maddelerden hücreler tarafından oluşturulan nitroz asid, sitozin, adenin ve guaninden 69. amino grubunu uzaklaştırır

71

Hücrede günde yaklaşık 10. 000 pürin kendiliğinden kaybolur. Baz değişimi veya kaybıyla ilgili hasarların düzeltilmesinde ilk olarak anormal bazlar, glikozilazlar tarafından özel olarak tanınarak deoksiriboz-fosfat iskeletinden N-glikozidik bağını yıkarak hidrolitik olarak uzaklaştırılırlar 72

pürin veya pirimidini uzaklaştırılmış apürinik/apirimidinik (AP) olarak tanımlanan bir bölge oluşur. AP endonüklezlar, AP bölgesini 5’ tarafından veya 3’ tarafından (AP endonükleazın türüne gore değişir) keserler. AP bölgeyi kapsayan DNA parçası uzaklaştırılıp DNA polimeraz I tarafından boşluk doldurulur. Kırık, DNA ligaz ile bağlanır. 73

Urasil-DNA glikozilazdan başka, hipoksantini, 3 -metiladenini ve 7 metilguanini tanıyan glikozilaz da vardır. Pirimidin dimerlerini tanıyan glikozilaz da bulunmuştur. 74

Nükleotid Kesip Çıkarma Onarımı DNA onarımı ile ilgili ilk çalışmalar, hasarlı nükleotidlerin onarılması üzerinedir. Güneş ışınlarının etkisinde kalan bir hücrede komşu primidinlerin, kovalent bağlanmaları ile oluşan timin dimerleri DNA polimerazların çalışmalarını ve DNA zincirinin replikasyonunu önler DNA heliks yapısında bozulmalara yol açan hasarlar genellikle nükleotid kesip çıkarma sistemleri ile tamir edilir 75

Timin dimerleri önce özel bir endonükleaz taafından tanınır sonra hasarlı kısmın iki tarafından zincir kırılır 76

77

78

Bu mekanizmada yer alan multi-fonksiyonl enzim Uvr ABC hasar spesifik endonükleaz (veya eksonükleaz) olarak adlandırılır. Bu enzim Uvr. A, Uvr. B ve Uvr. C proteinlerinden (alt birimlerinden) oluşur Uvr. A proteini ATPaz aktivitesi olan bir DNA bağlayıcı proteindir. Uvr. B proteininin tek başına ATPaz aktivitesi yoktur. Uvr. A proteinine bağlanarak aktive olduğunda ya da spesifik proteolizle yıkıldığında ATPaz 79

(Uvr. A)2 -(Uvr. B)1 kompleksi DNA üzerinde hasarlı bölgeye yakın bir yere bağlanır ve helikaz aktivitesi gösterir. DNA kıvrımın açarak ilerleyen (Uvr. A)2 -(Uvr. B)1 kompleksi hasarlı bazların bulunduğu yere gelince Uvr. A proteini kompleksten ayrılır. 80

Ayrılma işlemi, ATP hidrolizini gerektirir. Uvr. A proteini ayrılınca Uvr. C proteini Uvr. B , hasarlı DNA kompleksine bağlanır. Uvr. C proteininin komplekse bağlanmasıyla hasarlı bazların 3’ ve 5’ yönlerinde birer kırık oluşur. 81

Ø Hasarlı kısım helikazla ayrılır. Ø Boşluk DNA polimeraz I tarafından doldurulur ve Ø DNA ligazla zincir bağlanır 82

Az rastlanan bir genetik hastalık olan, kseroderma pigmentozumda , DNA yapısında meydana gelen dimerlerin hücreler tarafından onarılamaması, mutasyonların birikimine ve sıklıkla deri kanserine yol açar. 83

84

Yanlış Eşleşme Onarımı

Yanlış eşleşme daima kalıp zincirdeki bilgi baz alınarak tamir edilir DNA sentezi esnasında sentezlenen yeni zincir kısa bir süre için metillenmemiş bir yapıya sahiptir. Tamir sistemine ait proteinler metillenmeye göre kalıp zincir ve yeni sentez edilen zinciri ayırd edebilir ve yeni zincirdeki yanlış eşleşmeleri düzeltebilir

Yanlış Eşleşme Onarımı Direk onarım ve kesip çıkartma onarımında esas, normalde DNA molekülünde bulunmayan bazların tanınmasıdır. Yanlış eşleşme onarımında ise, değiştirilen normalde DNA molekülünde bulunan bazlardır. Bu nedenle, direk veya kesip çıkarma onarımı ile tanınmazlar. Yanlış eşleşme en çok replikasyon hatası olarak görülürsede rekombinasyon ve onarım işlemleri sırasında da yanlış eşleşme olabilmektedir. 87

Yanlış eşleşme her zaman eski zincirdeki bilgiye gore düzeltilir Onarım sisteminin, eski zincir ile yeni sentezlenen zinciri ayırd edebilmesi gerekir. Ayırım eski zincir üzerinde bulunan fakat yeni sentezlenmiş zincirde henüz bulunmayan metil grupları aracılığı ile olur. Dam metilaz, 5’ GATC dizisindeki adenini N 6 pozisyonunda metiller. Replikasyondan hemen sonra yaklaşık ilk bir dakika içinde eski zincir metillenmiş iken, yeni sentezlenen zincir henüz metillenmemiştir Bu kısa geçiş süresi yeni zincirin tanınmasını sağlar.

E. coli yanlış eşleşme onarım sisteminde Mut. S, Mut. H ve Mut. L proteinleri anahtar role sahiptirler Mut. S proteini yanlış eşleşmiş baz çiftinin içinde bulunduğu geniş bir bölgeye bağlanırken, Mut. H proteini GATC dizisini içeren bölgeye bağlanır. Mut. L proteini ise Mut. S ve Mut. H proteinlerini birbirine bağlayarak bir konmpleks oluşturur Sadece bir zincir GATC dizisinde metillenmiş ise ve yanlış eşleşmiş baz çiftine yakınsa (ilk 1000 baz çifti içinde ise) Mut. H proteini bir bölgeye özel endonükleaz olarak metillenmiş kolu GATC dizisinin 5’ ucundan keser. Böylece onarılacak olan kısım belirlenmiş olur. 89

Metillenmemiş kolda kıvrım açılır ve 3’ 5’ yönünde yıkıma uğrar Oluşan boşluk DNA polimeraz I ile doldurulduktan sonra zincir bağlanır Bu işlemler DNA helikaz II, SSB, ekzonükleaz I (DNA molekülünde sadece tek zincir 3’ 5’ yönünde yıkıma uğrar), DNA polimeraz III ve DNA ligaz gerektirir

Direkt Onarım Direkt onarım mekanizmalarında hasar, zinciri kırmadan uzaklaştırılmaktadır Sadece timin dimerleri ve alkillenmiş bazlar direk olarak onarılabilmektedir. Fotoreaktivasyon : Tek ve çift sarmal DNA üzerinde bulunan timin dimerleri 300 -600 nm dalga boyundaki ışıkla indüklenen, fotoliyaz tarafından birbirlerinden ayrılır. Bu enzim hem prokaryotlarda hemde ökaryotlarda bulunur. 91

DNA alkilasyonunun onarımı Alkilleyici maddelerin, mutajenik ve karsinojenik etkilerinden en fazla sorumlu olan hasar O 6 -metilguanindir (O 6 -MG) O 6 -MG, O 6 -metilguanin DNA metil transferaz (O 6 -MGMT, EC 2. 1. 1. 63) tarfından onarılır. E. collide Ada geni tarafından kodlanan ve monomerik bir protein olan O 6 -MGMT, guaninin O 6 konumundaki metil grubunu kendi üzerindeki spesifik bir sistein kalıntısına aktarır ve inaktive olur. Bir intahar enzimi olan O 6 -MGMT‘nin rejenerasyonu olmaz İnsan, O 6 -MGMT geni, 10. kromozomun uzun kolunda telomerik bölgede bulunur. 93

5. DNA Rekombinasyonu DNA molekülü içerisinde veya moleküller arasında genetik bilginin yeniden düzenlenmesi, genetik rekombinasyon adı altında toplanan pek çok işlemi içerir. Genetik rekombinasyon sistemlerinin fonksiyonları, mekanizmaları kadar çeşitlidir. Genetik farklılığın varlığı, özel DNA onarım sistemleri, belirli genlerin fonksiyonlarının açığa çıkışının düzenlenmesi ve gelişim esnasındaki programlanmış genetik düzenlenmeler, genetik rekombinasyon olaylarının bazı bilinen sonuçlarıdır. Genetik rekombinasyon fonksiyonları ile ilişkili tepkimeler üç sınıfta toplanır : 94

a. Homolog Genetik Rekombinasyon Homolog serileri kapsayan bölgeleri ortak kullanan, iki DNA molekülü veya aynı molekülün bazı bölümleri arasındaki genetik bilgi değişimini ifade eder. Birbirleri ile etkileşen iki DNA molekülü bir dereceye kadar benzer olan serileri ortaya koyarlar. Bu seriye koyma işlemi üç veya muhtemelen dört zincirin etkilendiği yeni DNA ürünlerinin oluşumunu da kapsayabilir. Rekombinasyon araürünü olarak dallanmış DNA yapıları da oluşur. Heliks yapıdaki iki makromolekül arasında bilgi değişimi, sıklıkla DNA zincirlerinin karmaşık bir şekilde birbirine karışmasını da kapsar. 95

Homolog genetik rekombinasyonun (aynı zamanda genel rekombinasyon olarak da adlandırılır) ökaryotlardaki hücre bölünmesi ile çok yakın bir ilişkisi vardır. Bu işlem sıklıkla mayoz bölünme sırasında gerçekleşir. Eşleşmiş uygun 2 n kromozomlu germ hücresi (diploid hücre) bölünerek yüksek ökaryotlarda sperm ve ovum hücreleri olan gametleri oluştururlar. Bu gametlerden her biri kromozom çiftinden yalnızca birini içerir (haploid hücre). Mayoz bölünme DNA molekülünün germ hücresinde coğalması ile başlar (Şekil 8. 52). Hücre içerisinde 4 kopya halinde DNA oluşmasından sonra hücre iki mayoz hücreye ayrılır. DNA içeriği haploid(n) düzeye inerken dört yeni gamet ortaya çıkar. 96

Mayoz bölünmenin ilk aşaması olan profaz I sırasında oluşan DNA kopyaları sentromerlerinden birbirleri ile bağlı olarak bulundukları için kardeş kromatidler adını alırlar. Bundan dolayı dört homolog DNA molekülünün her biri kromatid çifti şeklinde düzenlenir. Genetik bilgi mayoz bölünmenin bu aşamasında homolog genetik rekombinasyon ile birbirine yakın homolog kromotidler arasında değiş tokuş edilir. Bu işlem esnasında, DNA molekülünde kopma ve yeniden birleşmeler görülebilir. Sitolojik olarak gözlemlenebilen bu değiş tokuş çapraz geçiş olarak adlandırılır. Çapraz geçiş, iki çift kardeş kromatidi “chiasmata” denilen noktalarda birbirine bağlar. Dört homolog kromatidinin hepsi birbirine bağlanır ve bu bağlantı, sonuçta mayotik hücre bölünmelerinde uygun kromozomların ayrımına yardımcı olur (Şekil 8. 53). 97

Rekombinasyon veya çapraz geçiş, iki homolog kromozomun uzunluğu boyunca hemen her yerde gerçekleşebileceği için bir kromozom üzerinde iki noktayı birbirinden ayıran bir bölgedeki rekombinasyon sıklığı bu noktalar arasındaki uzaklığa bağlı bulunur. Genetik uzmanları bu bilgiyi, genler arasındaki mesafeyi ve birbirine göre durumlarını göstermek için uzun bir süredir kullanmaktadırlar. Bundan dolayı homolog rekombinasyon, genetik bilimin bir çok klasik bilgisini destekleyen moleküler bir işlemdir. Homolog gentik rekombinasyonun tespit edilen en az üç fonksiyonu vardır. Biri, toplumdaki genetik çeşitliliğe katkıda bulunur. Diğeri, ökaryotlarda ilk mayotik hücre bölünmesinde kromozomların düzenli olarak yavru hücrelere aktarılmasında önemli olan kromatidler arası geçici fiziki bağlantıyı sağlar. Sonuncusu ise, çeşitli DNA hasarlarının onarınıma katkıda bulunur. 98

Birinci ve ikinci fonksiyonlar, gen araştırmaları üzerinde çalışan bilim adamlarının en çok ilgilendikleri konu olan homolog rekombinasyon, sıklıkla genetik çeşitliliğin kaynağı olarak tanımlanmaktadır. DNA onarımı hücre içerisindeki en önemli fonksiyondur. DNA onarımı, bir iplikçikteki DNA hasarının hasar görmemiş iplikçikte bulunan genetik bilgi ile doğru olarak onarılması şeklinde tarif edilmektedir. DNA çift zinciri kopmaları, çift zincir çapraz bağlanmaları veya replikasyon sırasında tek zincirde oluşan hasarlar gibi belirli hasar tiplerinde tamamlayıcı kolun kendisi de hasarlı olabilir (Şekil 8. 54). Bu söz konusu olduğunda, doğru DNA onarımı için gerekli bilgi ayrı bir homolog kromozomdan gelmekte ve onarım homolog rekombinasyon işlemini kapsamaktadır. Bu tip hasarlar sıklıkla iyonizasyon yapan radyasyon ve oksidatif tepkimeler sonucu oluşmakta ve onarımları, ökaryotlarda canlı gametlerin oluşumu ve bakterilerin bulunması açısından önem taşımaktadır. Homolog 99 genetik rekombinasyon yoluyla yapılan onarım, rekombinasyonel

Homolog DNA molekülleri spesifik olmayan bir mekanizma ile bir araya gelirler. Her DNA molekülünün bir zinciri koparılmakta ve Holliday ara ürünü olarak adlandırılan bir çapraz geçiş yapısı oluşturmak için diğer zincir ile birleşmektedir. Değişik DNA moleküllerine ait zincirlerin çift oluşturduğu bölge, heterodupleks DNA olarak isimlendirilmekte ve zincir taşınması ile uzatılmaktadır. İki zinciri birbirinden ayıran Holliday ara ürünündeki kopmalar rekombinant ürünleri oluşturmak üzere onarılırlar. Aynı lineer gen düzenine sahip olan iki homolog kromozomun rekombinasyonunda her bir kromozomu meydana getiren bu genlerin bazılarında farklı baz dizileri bulunabilir. İnsanda hemoglobin için normal gen taşıyan bir kromozoma karşın bir diğeri ortak-hücre mutasyonu olan, orak hemoglobin geni içerebilir. Bu farklılıklar, milyonlarca benzer baz çifti arasından bir veya iki baz çifti arasında görülebilir. Homolog rekombinasyon, lineer gen dizilişini değiştirmesine rağmen tek bir kromozom üzerinde değişik genlerin hangilerinin birlikte bağlanacağını belirleyebilir. 100

Homolog rekombinasyonun bir veya daha fazla aşamasının gözlendiği prokaryot ve ökaryotlarda rekombinasyona spesifik enzimler izole edilmiştir. E. koli ile yapılan çalışmalar bu enzimlerin tanımlanması ve fonksiyonlarının anlaşılmasına yardımcı olmuştur. Önemli rekombinasyon enzimleri, rec. A, B, C, D ve ruv. C genleri ile kodlanmıştır. rec. B, C ve D genleri, DNA molekülünün açılması ve bazen iplikçiğin ayrılması sonucu rekombinasyonu başlatabilen rec BCD enzimini kodlar. Rec A proteini, iki DNA zincirinin eşlenmesi Holliday ara ürününün oluşumu, zincir kaydırılması gibi bütün işlemlerde önemli rol oynamaktadır. Bakteri ve mayalardan da izole edilen ve Holliday ürünlerini ayrıştıran nükleaz sınıf ‘resolvazlar’ olarak isimlendirilir. E. koli resolvaz Ruv. C proteinidir. 101

DNA onarımında önemli olan homolog rekombinasyon, hatalı DNA zinciri ile oluşturulan çiftten, dizilime ait önemli bilgiler elde ederek DNA onarımı sağlanır. DNA onarımında rekombinasyonun rolünü göstermek için normal replikasyon sırasında karşılan ve tek zincirli DNA molekülünde replike olmamış halde bırakılan hasarların onarımı replikasyon sonrası onarım olarak adlandırılır ve E. kolide bu işlem Rec. A proteini ile yapılır. 102

b. Bölgeye Özel Rekombinasyon Değişim yalnızca belirlenmiş DNA serileri arasında gerçekleşir. Replikasyon sonrasında onarım gerçekleştirilir. Her iki DNA zincirinde kırılmalara yol açarak hücre ölümüne neden olacağı için çift oluşturmamış DNA zincirindeki hasarlı kısım kesilip atılmaz. Kromozom kırılmasını önlemek ve onarımını sağlamak için hasarın bulunduğu bölgede tamalayıcı bir zincir bulundurulmalıdır. Rekombinasyon yolu, replikasyon çatalının diğer dalında homolog DNA yapısını kullanır. Rec A proteinine bağlı zincir değişim tepkimesi lezyonu kapsayan bölgeyi heterojen çift DNA molekülüne dönüştürerek homolog DNA molekülünden hasar görmemiş tamamlayıcı zincirin taşınmasını gerçekleştirir. Rec A proteinine bağlı DNA zincir değişimi ile bir çok DNA hasarı ATP hidrolizi sonucu sağlanan enerjinin yardımı ile etkin bir şekilde düzeltilmektedir. DNA çiftinin bir kısmında bir kez oluşan hasar hemen onarılmaktadır (Şekil 8. 56). Bölgeye özel rekombinasyon 103 kesin DNA düzenlenmesi ile sonuçlanır.

Gerçekte bütün hücrelerde oluşan ve bir türden diğerine büyük oranda değişklik gösteren bölgeye özel rekombinasyon tepkimelerinin fonksiyonları özelleşmiştir. Bu fonksiyonlar, belli genlerin açığa çıkışının düzenlenmesi, bir çok organizmada gelişim süresince oluşan parçalanmış DNA moleküllerinin yeniden düzenlenmesinin sağlanması bazı virüs ve Plazmid DNA yapılarında kopyalama döngüsüne bağlı DNA yeni düzenlemelerinden oluşur. Bölgeye özel rekombinasyon sistemi, rekombinaz adını taşıyan bir enzim ve bu enzimin etkili olabileceği kısa, sisteme bağlı olarak 20 -200 baz çifti içeren, bir rekombinasyon bölgesini taşıyan bir DNA dizisini içerir. Bazı sistemler aynı zamanda tepkime zamanlamasını ve sonucunu düzenleyen bir veya daha fazla sayıda yardımcı proteini de içerir. 104

c. DNA Transpozisyonu İmmunglobülin Genleri Rekombinasyonla Biraraya Gelir Gelişim esnasında oluşan programlanmış rekombinasyon olayının önemli bir örneğini immunglobulin genlerinin genom içinde yer alan gen bölgeleri oluşturur. B-lenfositler tarafından sentez edilen ve infeksiyoz bileşikler ile organizmaya yabancı olan bütün maddelere bağlanan moleküller olan immunoglobulinler (antikorlar), vertebralıların immun sistemlerinin en önemli bileşenleri arasında yer almaktadır. Yaklaşık 100. 000 civarında gen taşıyan insan genomunun farklı bağlanma özelliklerinin milyonlarca değişik antikor üretme yeteneği bulunmaktadır. Rekombinasyon, bir organizmaya küçük DNA kodlama kapasitesinden olağanüstü çeşitlilikte antikor üretme olanağı sağlar. 105