MIKROBIOLOGIJA NAUKA O MIKROORGANIZMIMA naziv potie od grkih

MIKROBIOLOGIJA – NAUKA O MIKROORGANIZMIMA - naziv potiče od grčkih riječi mikron ( mali ) I biologos ( nauka o životu ) - koristeći se najprostijim mikroskopom koji je sam konstruisao, Anthony van Leeuwenhoek ( 1632 – 1723 ) prvi je vidio opisao mikroorganizme

- Louis Pasteur ( 1822 – 1895 ) francuski hemičar, bavio se proučavanjem vrenja vina i ustanovio da ono nastaje pod dejstvom mikroskopski sitnih organizama – gljivica Proslavio se otkrićem gnojnih i anaerobnih infekcija i vakcine protiv besnila ( 1885. godine ) - Robert Koch ( 1843 – 1910 ) nemački ljekar, otkrio je uzročnika antraksa, tuberkuloze - Paul Erlich ( 1854 – 1915 ) tvorac teorije o otpornosti organizama koja se zasniva na prisustvu antitela i njihovoj reakciji sa antigenima. 1906. počinje da koristi specifičn lijek za liječenje sifilisa - salvarzan

- Alexander Fleming je 1928. godine otkrio da produkti gljivice Penicillium notatum djeluje na bakterije i pronašao je prvi antibiotik – penicilin.

PODJELA MIKROBIOLOGIJE - Bakteriologija – nauka o bakterijama - Protozoologija – nauka o protozoama - Mikologija – nauka o gljivicama i plijesnima - Virusologija – nauka o virusima i rikecijama Samo mali broj mikroorganizama predstavlja izazivače oboljenja, ostale vrste žive u zemljištu, vodi, vazduhu i nijesu opasne za čovijeka. Štaviše, prisustvo ovih mikroorganizama je značajno jer bez njih ne bi mogli da postoje ni drugi oblici života.

Struktura ćelije/Funkcija

MIKROSKOP MORFOLOGIJA ĆELIJE

Optički dijelovi - služe za uvećavanje i osvjetljavanje predmeta koji se promatraju 1. OKULAR - kratka cijev koja sadrži dva sočiva (gornje ili okularno i donje ili sabirno) - nalazi se na gornjem kraju tubusa - uvećanja okulara su: 1 x, 2 x, 5 x, 10 x, 15 x 2. OBJEKTIV - najvažniji optički dio mikroskopa -sočiva objektiva služe za skupljanje i koncentriranje zraka svjetlosti koje dolaze iz preparata i za povećavanje stvorene slike predmeta - MOĆ RAZDVAJANJA - najvažnija osobina objektiva -sposobnost sočiva da istakne fine detalje i strukturu - većina mikroskopa ima 3 objektiva s različitim uvećanjima: malo uvećanje (10 x) srednje uvećanje (40 x) veliko uvećanje (100 x)

Prema načinu posmatranja preparata razlikujemo 2 sistema objektiva: a) SUVI sistem objektiva b) ULJNO IMERZIONI (MOKRI) sistem objektiva - za posmatranje bakterija, njihovih oblika i rasporeda ćelija

3. KONDENZOR I IRIS-ZASLON - kondenzor se nalazi ispod stolića mikroskopa između izvora svjetla i promatranog preparata - sastoji se od sistema sočiva koje sabiraju svjetlosne zrake i usmjeravaju ih prema posmatranom preparatu - podizanjem ili spuštanjem kondenzor reguliše se snop svjetlosnih zraka tj. jače ili slabije osvjetljava preparat ( spuštanjem se smanjuje svjetlosni snop ) - iris-zaslon služi za kontrolu intenziteta svjetla

Mikroskop s svjetlim i tamnim vidnim poljem Disk za tamno polje

FAZNO KONTRASNI MIKROSKOP - POJAČAVA DIFRAKCIJU SVIJETLA KOJE PROLAZI KROZ UZORAK - koristi se poseban kondenzor s prstenastom dijafragmom

FLUORESCENTNI MIKROSKOP -upotrebljava se UV svijetlo - fluorescentne materije adsorbuju UV svijetlo i emituju vidljivo svijetlo - ćelije se mogu bojati fluorescentnim bojama

ELEKTRONSKI MIKROSKOP - kao izvor svjetlosti koriste se elektronski zraci čija je talasna dužina puno puta kraća od talasne dužine vidljivog dijela spektra što daje bolju rezoluciju - uvećanje ovog mikroskopa je 100 000 x i više

a. TRANSMISIJSKI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (TEM) - ultra tanke sekcije uzorka - prednost ovog mikroskopa je u velikoj moći razdvajanja što je pogodno za istraživanje različitih slojeva u preparatu - nepovoljno je što elektroni imaju ograničenu snagu prodiranja te se samo vrlo tanak sloj preparata može dubro istraživati - uvećanje 10, 000 -100, 000 x

- snop elektrona iz “elektronskog topa“ fokusiran je na malu površinu posebno prepariranog, ultratankog prereza uzorka - uz pomoć elektromagnetnih objektiva kondenzora kontroliše se osvjetljenost, fokusiranje i uvećanje - umjesto nanošenja preparata na predmetno staklo, kao kod svjetlosnih mikroskopa, u elektronskom se preparat nanosi na bakrenu mrežicu - snop elektrona prolazi kroz preparat, a potom kroz elektromagnetna sočiva objektiva i slika se povećava

b. SKENIRAJUĆI ELEKTRONSKI MIKROSKOP (SEM) - snop elektrona skenira površinu cjelokupnog uzorka a elektroni emitovani od uzorka stvaraju sliku -omogućuje dobivanje izrazito trodimenzionalne slike preparata -1000 -10, 000× moć uvećanja

- izbjegnut je problem rezanja preparata (priprema ultratankih presjeka) - primarni elektronski snop udara po površini preparata, a sekundarni snop elektrona, proizveden pomoću skupljača elektrona, upotrijebljen je za stvaranje slike na zaslonu ili na fotografskoj ploči

PRIPREMA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE -NATIVNI PREPARATI -OBOJANI PREPARATI vježbe!!!

Osnovna građa prokariotske i eukariotske ćelije

KARAKTERISTIKE PROKARIOTSKA ĆELIJA VELIČINA (µm) EUKARIOTSKA ĆELIJA 0, 5 -3 >5 ĆELIJSKI ZID Protein, peptidoglikan i lipidi Samo kod gljiva i biljnih ćelija, ali drugačija struktura CITOPLAZMATIČNA MEMBRANA Ne sadrži sterole (izuzev Mycoplasma vrste) Sadrži sterole JEDARNA MEMBRANA Ne Da GENOM Cirkularna DNA u nukleoid, 1 hromozom, genet. hapl (n) Linearna DNA u nukleusu, više hromozoma, gen. dip(2 n) ORGANELE (mitohondrije, Gol. komp, endo. ret. ) Ne Da RIBOZOMI 70 S (50 S+30 S) 80 S (60 S+20 S) ĆELIJSKA DIOBA Binarna fisija Mitoza i mejoza Produkcija energije Ćelijska memrana Mitohondrija

Tip ćelije Nuklearna membrana Eucarya eukariotski prisutna Bacteria prokariotski odsutna Archaea prokariotski odsutna Broj hromozoma Tip hromozoma Murein u ćelijskom zidu više od jednog linearan odsutan Jedan (najčešće) cirkularan prisutan jedan cirkularan odsutan Lipidi ćelijske membrane povezani estarskom vezom; nerazgranati; polinezasićeni povezani estarskom vezom; nerazgranati; zasićeni ili mononezasićeni odsutni povezani etarskom vezom; razgranati; zasićeni odsutni Goldži kompleks prisutan Endoplazmatski retikulum prisutan odsutan Ribozomi Mejoza i mitoza Produkcija energije 70 S (50 S + 30 S) odsutni citopl. membrana Steroli plazma membrane prisutni Organele (mitohondrije i hloroplasti) prisutni 80 S (60 S + 40 S) prisutni mitohondrije odsutni

Genom Escherichia coli je jednostavan, cirkularni hromozom veličine od 4. 68 miliona baznih parova DNA - zbog toga je genom E. coli kompletno sekvencioniran, pa znamo da on sadrži 4300 gena Eukariotske ćelije imaju tipično veće genome od prokariota.

-komparativnom analizom r. RNK sekvenci identifikovane su tri filogenetske linije ćelija -linije zvane carstva su: Bacteria, Archaea i Eukariota. Svi organizmi koji žive na Zemlji vode porijeklo od zajedničkog pretka

-virusi su klasa mikroorganizama, ali nijesu ćelije - virusima nedostaju mnoge osobine živih sistema - nijesu dinamički, otvoreni sistem - nemaju sopsvene metaboličke aktivnosti, ali sadrže njihove sopstvene genome - nemaju ribosome i njihova sinteza proteina zavisi od biosintetske mašinerije ćelija koje su inficirali - sadrže jedino DNA ili RNA, nikada obje nukleinske kiseline pa ih dijelimo na DNA i RNA viruse -virusi mogu inficirati sve tipove ćelija, uključujući bakterijske ćelije - virusi varijaju po veličini, najmanji virusi su veličine oko 10 nm u dijametru.

MORFOLOGIJA ĆELIJE -kod prokariota (bakterija) poznato je i opisano nekoliko formi ćelija - sferična ili elipsoidna forma - koke - cilindrični oblik -štapićaste ili bacili - spiralnim oblikom – spirile: - s manjim zavojem u vidu zareza - vibrioni - sa više zavoja - spirohete (u spirohete se ubrajaju borelije (više dugih zavoja koji su na krajevima zašiljeni), treponeme (brojni kratki zavoji, takođe, zašiljeni), leptospire (brojni mali zavoji sa zavrnutim krajevima, nalik na kuke) - mnoge bakterije se poslije ćelijske diobe mogu grupisati, npr. koke u vidu lanca - streptokoke, u vidu nepravilnih grozdova - stafilokoke, pravilnih paketa - sarcine

ODNOS POVRŠINE I ZAPREMINE -odnos površine i zapremine je od velike značajnosti za male ćelije - male ćelije sadrže veću površinu od relativne ćelijske zapremine, u odnosu na veće ćelije - to im omogućava brži metabolizam, hemijsku transformaciju, što je važno za reciklažu biogenih elemenata u prirodi, kao i za druge procese - odnos površine i zapremine se može demonstrirati na sferične oblike mikrobnih ćelija

Bakterijski ćelijski zid-osobine • zaštita od liziranja (osmotski pritisak) • čvrstoća i oblik • zaštita od hemijskih agenasa • reakcije bojenja po Gramu • toksični simptomi u bolesti (Gram-negativne bakterije) • osigurava potreban nosač za pokretanje flagela Bakterijske vrste se mogu svrstati u dvije grupe: Gram-pozitivne i Gram-negativne. Podjela na ove dvije grupe se bazira na reakciji Gram bojenja.

Peptidoglikan (mukopeptid, murein) -ćelijski zid Bacteria ima peptidoglikan, polimer u vidu mreže, koji je odgovoran za strukturni integritet i oblik bakteriskih ćelija (Kod Gram-negativnih bakterija dodatni slojevi su prisutni na spoljnoj strani ćelijskog zida) - peptidoglikan, je polisaharid koji se sastoji od glikanskih lanaca i tetrapeptida - glikanski lanci su linearni polimeri koji se sastoje iz repetativnih disaharida, dva derivata šećera: N acetilglukozamina i N acetilmuraminske kiseline i nekoliko aminokiselina uključujući: L-alanin, D-glutamin i lizin ili diaminopimelinsku (DAP) kiselinu - ovi konstituenti su povezani i formiraju ponavljajuću strukturu glikantetrapeptid

L-alanin, Dglutamin i lizin ili diaminopimelinsku (DAP) kiselinu

Lizozim prisutan u ljudskim suzama i sluzavim sekretima cijepa glikanske lance Spoljna membrana štiti bakterije od lizozima, dakle, samo grampozitivne bakterije su osjetljive.

DIVERZITET PEPTIDOGLIKANA - peptidoglikan je prisutan jedino kod Bacteria - šećer N-acetilmuraminska kiselina i aminokiselina diaminopimelinsku kis DAP nikada nijesu nađeni u ćelijskom zidu Archaea i Eukariota - međutim, sve Bacteria nemaju DAP u njihovom peptidoglikanu - prisutna je u svim gram-negativnim bakterijama i nekim gram-pozitivnim vrstama. Većina pozitivnih koka sadrže lizin Do sada, više od 100 različitih peptidoglikana je poznato

Peptidoglikan N acetilglukozamin - G N acetilmuraminska kis - M

N acetilglukozamin - G N acetilmuraminska kis - M

GRAM-POZITIVNI ĆELIJSKI ZID - kod Gram-pozitivnih bakterija više od 90% ćelijskog zida sadrži peptidoglikan -mnoge Gram-pozitivne bakterije imaju teihoičnu kiselinu, polialkohol koji se vezuje preko fosfatnih estera - teihoična kiselina se kovalentno veže za membranske lipide i kao takva se zove lipoteihoična kiselina - teihoična i lipoteihoična kiselina zajedno sa peptidoglikanom su antigeni (postoje razlike u sojevima) i mogu podpomognuti adheziju za tkivo domaćina - antitijela na teihoičnu kiselinu mogu ukazati na nedavnu infekciju s Gram-pozitivnim bakterijama. - teihoična kiselina razlikuje se kod različitih sojeva

SPOLJNE MEMBRANE GRAM-NEGATIVNIH BAKTERIJA -kod Gram-negativnih bakterija samo 10% ukupnog ćelijskog zida čini peptidoglikan - većina bakterija sadrži spoljašnju membranu koja predstavlja lipidni sloj, mada sadrži i polisaharide. Lipidi i polisaharidi su povezani u spoljnu membranu i formiraju kompleks kojise zove lipopolisaharidni sloj LPS - spoljašna membrana održava strukturu bakterija, djeluje kao permeabilna barijera i pruža zaštitu od štetnih uslova (npr. digestivni sistem domaćina)

Endotoksin -jedna od značajnih bioloških osobina spoljne membrane je njena toksičnost za čovjeka i sisare -Gram-negativne bakterije koje su patogene za čovjeka i druge sisare uključuju vrste. Salmonella, Shigella i Escherichia. -toksičnost je povezana za lipid A. - Neki endotoksini uzrokuju gastrointestinalne poremećaje, odgovorni su za brojne bakterijske bolesti, za infekcije hrane itd.

Citoplazmatična membrana Gramnegativnih bakterija je relativno permeabilna za male molekule - prisutni porini koji funkcionišu kao kanali za ulazak i izlazak hidrofilnih nisko-molekularno težinskih substanci - porin kanali su sastavljeni od proteina porina koji dopuštaju malim, hidrofilnim molekulima (uključujući antimikrobne molekule) da prođu kroz spoljne membrane, a ograničavaju i/ili blokiraju unos velikih ili hidrofobnih molekula

PERIPLAZMA -jedna od važnih funkcija spoljnih membrana je da održavaju proteine koji su prisutni s spoljne strane citoplazmatične membrane kako ne bi difundovali iz ćelije - ti proteini su prisutni u regionu koji se zove periplazma (oko 15 nm)

Gram negativne bakterije

KARAKTERISTIKE Gram-pozitivne bakterije Gram-negativne bakterije Spoljašnja membrana da ne Peptidoglukan debeo tanak Lipopolisaharidi odsutni prisutni Teihoična kiselina prisutna kod mnogih vrsta odsutna Kapsula, pili, flagele prisutne kod nekih vrsta Senzitivnos na lizozome veoma senzitivne opsežno rezistentne Antibiotska permeabilnost vrlo propusne za većinu nepropusne za mnoge Sporulacija neke vrste nijedna Produkcija egzotoksina neke vrste STRUKTURNE FUNKCIONALNE

ĆELIJSKI ZID Archaea - ćelijski zid odgovarajućih metanogenih Archaea sadrže polisaharide koji su veoma slični peptidoglukanu i oni se zovu pseudopeptidoglukan - osnovni sadržaj pseudopeptidoglukana je izmjenjena forma N-acetilglukozamina i N-acetilosaminurična kiselina - pseudopeptidiglukan se razlikuje još po glikozidnim vezama između derivata šećera koje su β 1, 3 tipa i po amino kiselinama koje su sve L-stereoizomeri N acetilglukozamin - G N acetilmuraminska kis - M