Promotori eucariotici RNA pol I trascrive r RNA

Promotori eucariotici RNA pol I trascrive r. RNA pol II trascrive m. RNA per proteine RNA pol III trascrive t. RNA e 5 S r. RNA

LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE

• Il legame promotore RNA polimerasi richiede i fattori di trascrizione generali

Promotori ~200 bp gene

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ Reporter gene 100% eg CAT, luciferase Reporter gene 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0%

COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE ATTIVITA’ Reporter gene 100% eg CAT, luciferase Reporter gene 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0%

Livello di trascrizione attivato basale represso

Elementi del Core promoter • siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region

RNAP II BRE TATA-box TATA ~24 bp Inr DPE 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

TFIIF TFIIE 2 subunits RNAP II TFIIA 2 -3 subunits TFIIB 1 subunit ~40 polipeptidi TFIID 12 subunits 10 subunits TFIIH 9 subunits

RNAP II BRE TATA-box 8 bp AT BRE 6 bp Inr ~24 bp Inr lega TFIID lega TFIIB DPE lega TFIID DPE

TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24 bp TFIIE TFIIH Inr DPE RNAP II

TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors —TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

TFIID BRE TATA ~24 bp Inr DPE

TFIIA BRE TFIID TATA ~24 bp Inr DPE -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

TFIIB TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24 bp Inr DPE -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24 bp Inr DPE RNAP II Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

TFIIE TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24 bp Inr DPE RNAP II TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

TFIIH TFIIF TFIID TFIIA TFIIB BRE TATA ~24 bp Inr DPE RNAP II TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

— REGOLATORI GENE SPECIFICI Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

Regolatori gene specifici • hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

(MADS box)

N Donatore H H O C Accettore

A D A A A M A A A D D A M A A D A A

Regolatori gene specifici 1) Contengono un dominio che lega il DNA 2) E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region

Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi? DNA loop

Enhancers- stimolano la trascrizione 1. Attivatori si legano ad un sito specifico 2. Il DNA si ripiega

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

Enhancers- stimolano la trascrizione Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

Controllo combinatoriale dell’espressione genica

Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

Heterodimerization of DNA binding proteins can alter their sequence specificity

Enhancer e Repressori promotore enhancer repressore 10 -50, 000 bp RNAP gene enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer

Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche • Cambio dell’attivita’ • Cambio della localizzazione cellulare

Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali TAF RGRACANNNTGTYCY TBP RNA pol II TAF

Nuclear Receptors Legame dell’ormone Dissociazione da hsp 90 GR GR hsp 90 dimerizzazione GR GR Migrazione nel nucleo Legame al DNA TATA

Regolazione mediante fosforilazione • Ormoni attivano una chinasi • La chinasi fosforila un fattore di trascrizione • Il fattore e’ attivato

Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase) MEKK P SEK P MEKK fosforila SEK – una MAP kinase P JNK P SEK fosforila JNK – una MAP kinase

Cascata delle chinasi JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 nucleo P AP-1 attiva la trascrizione legandosi a – TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali RNA pol II JNK P P C-JUN C-FOS TRE

Metilazione del DNA • La citosina puo’ essere metilata: • Risulta in una maggiore condensazione della cromatina • La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X

Trascrizione e struttura della cromatina • Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile • La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente • La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

Acetilazione degli Istoni • E’ una modificazione post-traduzionale • Gruppi acetilici (CH 3 COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive • Eliminano le interazioniche con il DNA • Diminuiscono la condensazione • Associati con una attiva trascrizione

– Acetilazione/Deacetilazione

Attivatori: acetilazione degli Istoni • Alcuni attivatori attirano delle acetilasi • Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

Alcune Istone Acetilasi (HAT) • • p 300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

Repressori: deacetilazione degli Istoni • Alcuni repressori attirano delle deacetilasi • Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

– Acetilazione/Deacetilazione

SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC 2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

Macchinari di Rimodellamento • Tutti contengono subunita’ simili a swi 2/snf • NTP-binding proteins

Regolazione dell’Espressione Genica Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: NUCLEUS CYTOSOL inactive m. RNA degradazione DNA RNA transcript trascrizione m. RNA Maturazione m. RNA trasporto traduzione protein controllo dell’attivita’ inactive protein

Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene • Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ • Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili • Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici

L’RNA Editing altera le sequenze dei prem. RNA Figure 11 -39

• m. RNA editing Nel fegato La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nell’intestino

Metodi per studiare l’espressione dei geni • • • Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

Purificazione dell’RNA • Procedura – Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi – Rimozione delle proteine – Precipitazione specifica dell’RNA

Northern blot • Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici m. RNA • Studi sull’espressione genica

Northern blot – Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare – Trasferimento dell’RNA su una membrana – Ibridazione con una sonda marcata

tampone elettroforetico es. TAE (4 m. M Tris-acetato, 1 m. M EDTA, p. H 8. 0) generatore di corrente gel di agarosio 100 V - + 0, 2 A scatola elettroforetica

Gel Elettroforesi. Separa le molecole in base alla dimensione

Trasferimento su supporto solido

Trasferimento dal gel alla membrana

Dopo il trasferimento gel membrana

Preparare la sonda per il Northern Blot

Ibridazione • La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

Lavaggio • Rimozione della sonda non legata al supporto solido

Rivelazione degli ibridi • Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente • Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

Northern blot • La rivelazione avviene usando: – DNA marcato con radioattivo(32 P) – DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

Northern blot Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for El. LTP 1 (top panel) and El. LTP 2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

Svantaggi del Northern Blot • Richiede grandi quantita’ di RNA • E’ un processo lungo e laborioso

Ibridazione dell’RNA in situ Rivelazione di m. RNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T 7/T 3 or SP 6 promoter

RNA in situ hybridization Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5 -bromo-4 -chloro-3 indolyl phosphate (BCIP) Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for El. LTP 1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

• Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene • Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’

permette di determinare il livello di trascrizione di un gene 1) 2) 3) 4) 4) 5) Purificare i nuclei + NTP, 32 P GTP Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva Estrazione dell’RNA Ibridazione a c. DNA immobilizzato su filtro

codificanti m. RNA epato-specifici analizzata tramite run-on Lodish Figure 10 -23

Northern blotting RNA isolation Probe labeling AAAAAA d. CTP d. GTP d. TTP d. ATP p. BS-Sema. III Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography

reverse Northern blotting Northern reverse Northern