Genomi dei procarioti Una molecola circolare di DNA

Genomi dei procarioti Una molecola circolare di DNA E. coli circa 4 x 106 coppie di basi Il genoma è quasi tutto codificante Viene trascritto in m. RNA policistronici

Il genoma eucariotico si trova nel nucleo Singole molecole lineari di DNA organizzate in cromosomi. I geni vengono trascritti in molecole di RNA messaggero (m. RNA ) monocistronici (1 molecola di m. RNA codifica per 1 proteina) Geni: solo ~ 2% del DNA genomico umano.

Funzioni del genoma • La funzione primaria del genoma è di immagazzinare, propagare, ed esprimere l’informazione genetica. • Il genoma è anche una componente strutturale della cellula: Funzione meccanica.

Genoma umano Singole molecole lineari di DNA 22 autosomi presenti in duplice copia (genoma diploide) 2 cromosomi sessuali X Y maschio; X X femmina Per un totale di 46 cromosomi ~6 x 109 coppie di basi (~2 metri lineari) Viene trascritto in m. RNA monocistronici

Il genoma umano Genoma diploide: 46 molecole lineari di DNA (cromosomi), ~6 x 109 bp. - 22 cromosomi autosomici presenti in duplice copia. - 2 cromosomi sessuali: X Y maschio; X X femmina.

Bandeggio crmosomico Il Bandeggio si basa su trattamento con colorazione Giemsa (eosina, blu di metilene, azzurro di metilene) genera ~320 bande di ~6 -8 Kb in cromosomi metafasici. Bandeggio G (Giemsa) Eterocromatina colorate (AT rich) Eucromatina non colorate (CG rich) Bandeggio R (Reverse) Trattamento a 60ºC Eterocromatina non colorate (AT rich) Eucromatina colorate (CG rich) Bandeggio C (Constitutive Chromatine) Denaturazione alcalina causa depurinazione seguita da colorazione Giemsa

Cariotipo umano colorato con il Giemsa (bande G) Giemsa: maggior affinita’ per il DNA ricco in A e T Bande G appaiono scure nel cariotipo perche’ hanno un contenuto A/T >>50% Contenuto A/T dei geni e’ < 50%

Mouse Karyotype

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S. p. A. Copyright ©

Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE,

Figure 5. 1 b

Sequenziamento del genoma Sequenziamento con metodo Sanger Watson et al. , BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S. p. A. Copyright © 2005

Sequenziamento massivo parallelo (next generation sequencing, NGS) Sequenziamento parallelo Frammentazione random Assemblaggio

I genomi di molte specie (compreso uomo e topo) sono interamente sequenziati e disponibili sul web. Strategia di sequenziamento Frammentazione In piccoli segmenti Parzialmente sovrapposti agctct……tctgaaaggctcccc…. . tgatgta Sequenziamento dei frammenti Assemblaggio della sequenza completa agctct…. . tctgaaaggctccccc……. tgatgta

Il genoma di molte specie animali e vegetali è sequenziato e disponibile online Ensembl: (www. ensembl. org) UCSC genome browser (http: //genome. ucsc. edu/) Per quello che riguarda l’uomo, sono disponibili le sequenze genomiche di migliaia di individui. Il sequenziamento su larga scala ha costi accessibili anche per laboratori di ricerca relativamente piccoli (~500 euro/genoma)

Cromatina -> nucleo <citoplasma

Cromatina = DNA+proteine specializzate

Il nucleosoma è l’unità minima di compattamento del DNA cromosomico

Nucleasi micrococcica Isolata da Staphylococcus Aureus MNase ( P 19 Cl 6 cells) approx. 450 300 150 G. Fulcoli

Le interazioni tra il core istonico e il DNA sono mediate da molti contatti indipendenti dalla seq. nucleotidica dimero H 3. H 4 1) 14 siti di contatto tra l’ottamero istonico e il DNA 2) >140 legami idrogeno tra gli istoni e gli atomi di ossigeno dei legami fosfodiestere forniscono l’energia per curvare il DNA 3) la natura basica degli istoni maschera la carica negativa del DNA e permette al DNA di curvare attorno al core istonico.

Farmaci possono essere usati per modulare le modificazioni istoniche G. Fulcoli

Mutazioni geniche e modificazioni istoniche G. Fulcoli

Il DNA batterico e’ altamente condensato • Il DNA batterico e’ compattato in nucleoidi, strutture meno note rispetto alla cromatina eucariotica • In E. coli, circa 500 anse di DNA lungo 10 kbp sono attacate alla superficie interna della membrana plasmatica Punti di connessione alla membrana plasmatica

Geni e Genomi

Che cosa e’ un gene? • Unità fondamentale dell’eredità genetica (codifica molecola funzionale). • Un gene e’ costituito da sequenze codificanti (esoni) e sequenze non-codificanti (introni) • I geni sono separati da regioni intrageniche contenenti elementi regolatori • La dimensione dei geni e’ molto variabile; il gene che codifica la distrofina e’ lungo 2. 2 x 106 bp; la OXT (ossitocina) 896 bp

Dove sono localizzati i geni nel genoma eucariotico?

• Distribuzione piu’ o meno casuale con variazione della densita’ genica nelle diverse posizioni del cromosoma • Arabidopsis (erba galletta): densita’ genica media di 25 geni ogni 100 kb di DNA (varia da 1 a 38). Situazione simile al genoma umano

Come sono organizzati i geni nel genoma umano?

Un segmento contiguo da 50 kb del cromosoma 12 umano 4 Geni (25% del segmento, esoni, 9%) PKP 2: codifica una proteina coinvolto nella sintesi di desmosomi SYB 1: codifica una proteina di membrana FLJ 10143: ? funzione CD 27: codifica una proteina che regola le vie di trasduzione del segnale 7 microsatelliti (<1%) brevi motivi ripetuti in tandem, CAGCAGCAG 88 sequenze ripetute intersperse (45%) che si trovano distribuite in tutto il genoma; LINE; SINE; LTR LINE: long interspersed nuclear elements SINE: short interspersed nuclear elements LTR: long terminal repeats DNA a singola copia, (30%) non-genico, nonripetitivo, senza funzione nota

La dimensione del genoma • Misurato in numero di coppie di basi per genoma aploide (singola copia del genoma) • Organismi che si riproducono sessualmente hanno un genoma diploide; due copie del genoma, una ereditata dalla madre e l’altra dal padre • La dimensione del genoma degli eucarioti, anche quelli piu' semplice (lievito), e' un ordine di grandezza maggiore rispetto al genoma dei batteri. • Non esiste una precisa correlazione tra la complessita’ dell’organismo e la dimensione del suo genoma

dimensione del genoma in varie specie 3. 12 miliardi bp ~35. 000 geni

Organizzazione di altri genomi eucariotici Il genoma del lievito e’ molto compatto Nel segmento illustrato di 50 kb: 26 geni, nessun gene discontinuo (nessuno introne), poche sequenze ripetitive, regioni intrageniche piccole

Compattezza di tre genomi Caratteristica Lievito Moscerino della frutta Uomo Densita’ genica: No. 497 geni per megabase di DNA 76 11 Introni per gene 0, 04 3 9 % genoma occupato da sequenze ripetute intersperse 3, 4% 12% ~45%

Il DNA ripetitivo del genoma eucariotico • DNA ripetuto intersperso; blocchi di sequenze che sono disperse in tutto il genoma in maniera pseudocasuale (LINE, SINE). • DNA ripetuto in tandem (DNA satellite); unita’ ripetute localizzate una a fianco all’altra (LTR, STR). • DNA alfoide del centromero: Seq. lunghe 171 bp che sono ripetute dalle 1500 alle 30. 000 volte. DNA non-codificante. Potrebbe svolgere un ruolo strutturale, ad es. sito di legame per proteine centromero-specifico. • Minisatelliti: unita’ ripetuta lunga fino a 25 bp, raggruppate in blocchi di lunghezza fino a 20 kb, ad es. DNA telomerico. • Microsatelliti: unita’ ripetuta lunga 13 bp o meno, raggruppati di lunghezza fino a 150 bp, sono disperse in tutto il genoma

Quanti geni e quali le loro funzioni?

Categorie funzionali dei geni umani • Le funzioni di >50% dei ~25. 000 geni umani sono note o possono essere dedotte con un ragionevole margine di sicurezza • La maggior parte codifica per proteine; <10% specificano vari tipi di RNA funzionale • Le tre categorie principali rappresentano le aree piu’ studiate della biologia cellulare • I geni i cui prodotti non sono stati ancora identificati sono, con molta probabilita’, coinvolti in attivita’ cellulari meno studiate

Genoma mitocondriale umano - primo genoma (non virale) ad essere sequenziato - densa compattazione dei geni - geni codificano per 13 proteine e 24 RNA funzionali (22 t. RNA; 2 r. RNA) - dimensione del genoma: 16, 569 coppie di basi - poche sequenze regolatrici

L’origine dei genomi degli organelli La teoria dell’endosimbionte: 1) similarita’ nei processi di espressione genica che avvengono nei mitocondri eucariotici e nei batteri 2) sequenza nucleotidica dei geni mitocondriali e’ piu’ simile a geni equivalenti dei batteri che non ai geni nucleari eucariotici

RIASSUNTO I • Il genoma eucariotico e’ suddiviso in una seria di molecole lineari di DNA, I cromosomi • Il DNA e’ associato a proteine istoniche costituendo i nucleosomi, l’unita’ di base della cromatina • La doppia elica è avvolta intorno al nucleosoma, con andamento sinistrorso (superavvolgimento negativo) • Le code N-terminali istoniche sono al cuore della regolazione dinamica della struttura cromatinica • L’organizzazione piu’ compatta della cromatina e’ quella dei cromosomi metafasici

RIASSUNTO II • Il centromero, che e’ visibile nei cromosomi metafasici, e’ costituito da lunghi tratti di DNA ripetitivo noto come DNA alfoide • I telomeri contengono DNA ripetitivo (minisatellite) • Il 44% del genoma umano e’ costituito da sequenze ripetitive, distinte in seq. ripetitive intersperse e in tandem • I geni non sono distribuiti uniformemente lungo i cromosomi e la densita’ e’ altamente variabile