Lezione 6 Trascrizione nei procarioti e negli eucarioti

Lezione 6 Trascrizione nei procarioti e negli eucarioti Regolazione dell’espressione genica 1

Trascrizione Processo mediante il quale l’informazione contenuta in una sequenza di DNA (gene) viene copiata in una sequenza complementare di RNA dall’enzima RNA polimerasi 2

Solo una frazione del genoma viene trascritta, quella CODIFICANTE, organizzata in unità funzionali dette GENI Trend evolutivo: con l’aumentare delle dimensioni del genoma aumenta la frazione non codificante 4300 geni 4, 6 X <20000 geni 700 X dimensioni: 4, 7 12, 1 3 100 3300 Mb

Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi sequenze non codificanti Gene 1 Gene 2 Gene 3 Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non codificanti Gene 1 Gene 2 Gene 3 4

DNA non codificante 1 * < 2% del nostro genoma è rappresentato da sequenze esoniche * Più del 98% del genoma umano è composto da sequenze non codificanti proteine * 26% del genoma umano è rappresentato da regioni introniche e sequenze regolatrici dell’espressione genica Sequenze regolatrici 5

DNA non codificante 2 * Una grossa percentuale del genoma umano è rappresentato da retrotrasposoni (elementi in grado di copiarsi e poi di integrarsi in altre posizioni del genoma) (8% sono sequenze di origine retrovirale) * Geni per RNA non codificanti proteine (r. RNA, t. RNA, RNA coinvolti nella regolazione della trascrizione genica o nell’ inattivazione del cromosoma X) * Pseudogeni (c. a. 20. 000 sequenze simili a geni ma non più funzionanti) 6

Pseudogeni L’inattivazione non ha effetti negativi perché rimane la copia originaria del gene Il gene duplicato può accumulare mutazioni che fanno assumere nuove funzioni: famiglie geniche 7

Trascrizione gene Filamento stampo (coding strand) Per ogni gene uno solo dei due filamenti del DNA è codificante 8

Geni diversi posti sullo stesso cromosoma possono avere come “coding strand” filamenti diversi del DNA + - 9

Visione d’insieme della trascrizione 10

Inizio della trascrizione la RNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza del promotore e “copia” il filamento di DNA stampo a partire dal sito di inizio della trascrizione 11

Promotore E’ una sequenza specifica del DNA che viene riconosciuta dalla RNA polimerasi e determina DOVE la sintesi del m. RNA inizia e QUALE filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo. Sito di inizio della denaturazione Promotore procariotico 12

Allungamento della catena dell’RNA G C C G CU GA CC TC I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può essere copiato. La RNA polimerasi, a differenza della DNA polimerasi, non ha bisogno di un innesco Procarioti: RNA polimerasi si lega direttamente al promotore Eucarioti: fattori di trascrizione proteici legano il promotore prima dell’ RNA 13 polimerasi II

Allungamento della catena dell’RNA 3’ La RNA polimerasi ha attività elicasica 14

Allungamento della catena dell’RNA A differenza delle DNA polimerasi, le RNA polimerasi non hanno attività di “proof reading” 15

Effetto di errori delle polimerasi DNA mutato trascrizione Errore della DNA polimerasi Tutte le molecole di RNA portano la mutazione DNA wt trascrizione Errore della RNA polimerasi 16 Una sola molecole di RNA porta la mutazione

Terminazione Sequenze specifiche sul DNA (terminator) determinano l’arresto della trascrizione in corrispondenza di un determinato nucleotide (STOP site) 17

Alfa amanitina inibisce le RNA pol eucariotiche Polipeptide biciclico L'avvelenamento con le amanitine è caratterizzato da un lungo periodo di latenza (dalle 6 alle 48 ore, in media 6 -15 ore) durante il quale il paziente non accusa alcun sintomo. Le cellule, rese incapaci di sintetizzare nuove proteine, interrompono bruscamente le proprie attività. Le cellule del tratto intestinale e del fegato sono le più drasticamente colpite non appena vengono in contatto con la sostanza e, nel caso di avvelenamento grave, l'unica possibilità di salvezza è il trapianto di fegato.

Nei procarioti il trascritto viene subito tradotto in proteina … 19

… nel nucleo delle cellule eucariotiche invece avviene un complicato processo di MATURAZIONE prima che il trascritto venga esportato nel citoplasma e tradotto. 20

Dal nucleo al citoplasma pori nucleari linfocita visto al M. E. dopo criofrattura Dal nucleo dove avviene la trascrizione, gli RNA messaggeri maturi passano attraverso i pori nucleari nel citoplasma, dove vengono tradotti 21

Splicing Nei geni degli eucarioti le sequenze codificanti per proteine (esoni) sono interrotte da sequenze non codificanti (introni). Il trascritto primario, prima di abbandonare il nucleo, viene sottoposto ad un processo di taglio e ricucitura (splicing): gli introni vengono eliminati e gli esoni riuniti uno all’altro. La molecola di m. RNA maturo che esce dal nucleo sarà costituita da una sequenza codificante continua. 22

Splicing alternativo 23

Splicing alternativo * Il fenomeno dello SPLICING alternativo negli eucarioti aumenta il potenziale espressivo del genoma * E’ la regola, non l’eccezione * Mediante forme di splicing alternativo da uno stesso gene possono derivare trascritti diversi che, una volta tradotti, danno luogo a proteine simili ma diverse 24

Potenziale espressivo in H. sapiens * In H. sapiens si stima che la percentuale di geni che subiscono splicing alternativo sia >90% (Hallegger M et al. , 2010) * N° geni H. sapiens : 20. 000 * 18. 000 geni subiscono AS * Il numero medio di varianti di splicing prodotto da ciascuno di questi geni è 4 (Kim H et al. , 2004) * La stima del numero di proteine prodotte da 20. 000 geni è di 72. 000 25

Splicing alternativo dell’ m. RNA per la tropomiosina (5 isoforme) Tropomiosina: proteina che lega l’actina (coinvolta nella contrazione muscolare) e fa parte delle proteine del citoscheletro nelle cellule non muscolari 26

Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…. . Nei procarioti più geni possono essere trascritti in un unico m. RNA policistronico permeasi fa entrare il lattosio nella cellula enzimi che digeriscono il lattosio Regolazione coordinata dell’espressione genica: geni che codificano per proteine coinvolte nella stessa via metabolica (es catabolismo del lattosio) vengono trascritti contemporaneamente poiché sono sulla stessa molecola di m. RNA 27

Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…. . Negli eucarioti sempre 1 m. RNA = 1 gene Stabilizzazione m. RNA Legame al ribosoma Stabilizzazione m. RNA Esportazione m. RNA dal 28 nucleo Modificazioni post-trascrizionali del messaggero (5’CAP e coda di poli. A)

La quantità di un m. RNA nella cellula dipende dalla sua velocità di sintesi e di degradazione L’emivita di un m. RNA determina la quantità di proteina sintetizzata 29

m. RNA eucariotico Sequenza trascritta e maturata Sequenza tradotta UTR=Un. Translated Region 30

Regolazione dell’espressione genica Solo alcuni geni vengono costituzionalmente trascritti per ogni cellula (geni housekeeping: enzimi del metabolismo, RNA polimerasi, ribosomi, istoni…) Per tutti gli altri esistono molti meccanismi che permettono di regolare se, quando (meccanismi di regolazione temporali) e quanto un gene deve essere trascritto Ciò è particolarmente evidente e importante negli organismi eucarioti multicellulari dove esiste una regolazione tessuto specifica (cellule diverse producono proteine diverse) Anche nei procarioti tuttavia vi sono meccanismi di regolazione dell’espressione genica OPERONI 31

Espressione tessuto-specifica cardiomiocita neurone epatociti Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti Il pattern di geni espressi per ogni tipo cellulare è diverso 32

Potenziali punti di controllo dell’espressione genica 1 Pre-trascrizionale In primo luogo la conformazione della cromatina condiziona la trascrizione (cromatina addensata = trascrizionalmente inattiva) EUCARIOTI 33

Potenziali punti di controllo dell’espressione genica 2 Controllo trascrizionale: esercitato da interruttori molecolari, fattori di trascrizione. Proteine che si legano al DNA nel sito promotore dei singoli geni o in corrispondenza di altre sequenze regolatrici (enhancers, silencers) poste anche a 20 kb dal gene 34

Fattori di trascrizione: meccanismo d’azione Sequenza di riconoscimento specifica 35

Regolazione coordinata dell’espressione genica Un unico fattore di regolazione dell’espressione può controllare diversi geni. Esempio: Recettore degli Estrogeni (ER) Nucleo gene 2 gene 3 gene 4 gene 1 ERE Estrogen Responsive Element 5’-GGTCAnnn. TGACC-3’ Questa sequenza di riconoscimento specifica si trova nel promotore di tutti i geni controllati da ER

Potenziali punti di controllo dell’espressione genica 3 Splicing alternativo regolato da proteine cellula-specifiche Stabilità del m. RNA (l’emivita del messaggero incide sulla quantità di proteina sintetizzata) Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze specifiche per la stabilità del messaggero Inizio della traduzione: Può essere bloccata da proteine regolatrici o fino all’aggiunta del 5’ CAP 38

Inibizione selettiva della traduzione di m. RNA materno legato a proteine che inibiscono la traduzione Alcuni dei più notevoli casi di regolazione traduzionale dell’espressione genica avvengono nell’oocita. L’oocita produce e accumula m. RNA che spesso verranno utilizzati solo dopo la fecondazione. 39