La regolazione dellespressione genica nei procarioti Adattamento dei

La regolazione dell’espressione genica nei procarioti

Adattamento dei microrganismi alle condizioni ambientali

Risposta di E. coli alla presenza di lattosio

-galattosidasi, permeasi e transacetilasi

La sintesi degli enzimi -galattosidasi, permeasi e transacetilasi è regolata In assenza di lattosio sono presenti 2 -3 molecole di ciascun enzima nella cellula In presenza di lattosio le molecole dei tre enzimi arrivano a circa 3000 ambiente esterno ambiente interno della cellula galattosio glucosio galattosio permeasi b-galattosidasi transacetilasi

L’operone lac in E. coli Viene definito OPERONE un gruppo di geni che appartengono a un’unica unità trascrizionale la cui espressione è regolata in modo coordinato

L’analisi genetica del sistema lac in E. coli (1960 -1964) Jacob, Lwoff e Monod, Premio Nobel Medicina 1965

L’analisi genetica del sistema lac in E. coli • Isolarono mutanti di E. coli incapaci di metabolizzare il lattosio (non producevano enzimi funzionali) • Le mutazioni appartenevano a tre gruppi di complementazione che corrispondevano a tre geni strutturali: • lac. Z+ lac. Y+ e lac. A+ codificanti rispettivamente -gal, permeasi e transacetilasi • I tre geni erano strettamente associati sul cromosoma batterico

L’analisi genetica del sistema lac in E. coli Le mutazioni nei geni strutturali lac. Z+ lac. Y+ e lac. A+ erano di due tipi: • Missenso: mutazioni a carico di un singolo gene portavano ad un enzima non funzionale • Nonsenso: mutazioni a carico di lac. Z+ che mostravano effetti polari, riducevano anche la sintesi degli enzimi codificati dai geni lac. Y+ e lac. A+ che si trovano a valle MUTAZIONE NON SENSO STOP DELLA TRADUZIONE RILASCIO DI UNA PROTEINA TRONCA L’identificazione di mutazioni “polari” fu fondamentale per lo sviluppo del concetto di operone, come unità coordinata di espressione genica

Natura molecolare delle mutazioni polari • Inserzione o delezione di singole basi (frame-shift) • Sostituzioni nucleotidiche causano la formazione di codoni di stop della traduzione UAA UGG • Queste mutazioni causano l‘interruzione della traduzione con formazione di un polipeptide più corto

Il messaggero poli-cistronico Grazie all’effetto delle mutazioni polari Jacob e Monod ipotizzarono che i tre geni fossero trascritti in un unico messaggero poli-cistronico

Le mutazioni costitutive alterano la risposta dei batteri alla presenza/assenza del lattosio Jacob e Monod isolarono anche un’latra categoria di batteri mutanti. Le mutazioni mappavano in geni diversi da lac Z+ lac. Y+ e lac. A+. Queste mutazioni inoltre differivano da quelle nei geni strutturali lac Z+ lac. Y+ e lac. A+ , perché alteravano la modalità di sintesi delle proteine -galattosidasi, permeasi e transacetilasi in risposta alla presenza/assenza di lattosio nel terreno di crescita. Le mutazioni producevano un fenotipo costitutivo di sintesi dei tre enzimi, ovvero i tre enzimi venivano prodotti anche in assenza di lattosio. Dall’effetto di queste mutazioni che vennero chiamate “costitutive”, Jacob e Monod ipotizzarono che si trattasse di mutazioni in geni regolatori e non in geni strutturali come lac Z+ lac. Y+ e lac. A+

Diverse categorie di mutanti costitutivi Sintesi di -galattosidasi, permeasi e transacetilasi genotipo induttore assente induttore presente - + Oc + + I- + + Is - - I-d + + IQ - +* ISQ - +* Wild-type * indotti da alte concentrazioni di lattosio

. Le mutazioni regolative furono mappate inizialmente in tre geni: O+, I+ e P+

Geni strutturali e geni regolatori operatore lac. I+ P +O+ lac. Z+ -galattosidasi Repressore promotore lac. Y+ permeasi lac. A+ transacetilasi

Utilizzo dei diploidi parziali Per capire la funzione dei geni O+ ed I+ furono costruiti dei diploidi parziali utilizzando la sesduzione

Diverse categorie di mutanti costitutivi Sintesi di b-galattosidasi, permeasi e transacetilasi genotipo induttore assente induttore presente - + Oc + + I- + + Is - - I-d + + IQ - +* ISQ - +* Wild-type * indotti da alte concentrazioni di lattosio

La funzione del gene I+ lac. Z+ lac. Y+ F’ lac. I+ lac. O+ lac. Z- lac. Y+ lac. I- lac. O+ lac. Z+ lac. Y- lac. I+ lac. O+ lac. Z- lac. Y+ - lattosio - - + lattosio + + sintesi inducibile di lac. Y+ lac. I- lac. O+ lac. Z+ lac. Ysintesi costitutiva di lac. Z+ Da questo esperimento si dedusse che I+ è trans dominante e si ipotizzò che codificasse per una prodotto diffusibile nel citoplasma (proteina o RNA) in grado di influenzare anche i geni in trans

La funzione di O+ lac. Z+ lac. Y+ F’ lac. O+ lac. Z- lac. Y+ lac. Oc lac. Z+ lac. Y- - lattosio + lattosio F’ lac. O+ lac. Z- lac. Y+ lac. Oc lac. Z+ lac. Y- + + + sintesi inducibile di lac. Y+ sintesi costitutiva di lac. Z+ Si ipotizzò che Oc fosse una mutazione cis dominante in grado di influenzare solo i geni in cis e che di conseguenza il gene O+ non producesse una proteina diffusibile ma corrispondesse a un sito di regolazione (operatore)

Effetto mutazioni I- in condizione aploide

Diploidi parziali eterozigoti I+ I- in assenza di lattosio

Diploidi parziali eterozigoti I+ I- in presenza di lattosio

Effetto di mutazioni I S in presenza di induttore nei diploidi parziali

Effetto di mutazioni Oc in assenza di lattosio nei diploidi parziali

Effetto di mutazioni Oc in presenza di induttore nei diploidi parziali

Il controllo negativo dell’ Operone Lac Jacob e Monod ipotizzarono che in assenza di lattosio la proteina prodotta dal gene I+ (repressore) si legasse alla sequenza del gene O+ impendendo la trascrizione dei geni strutturali a valle. In presenza di lattosio, esso si lega al repressore favorendo il suo distacco dal gene O+ e consentendo alla polimerasi di legarsi al promotore per iniziare la trascrizione dei geni a valle. I+ O+ Z+ -galattosidasi Y+ A+ permeasi transacetilasi L’operone lac è un sistema di controllo negativo Gli operoni si trovano nei procarioti

In assenza di lattosio I+ O+ Z+ Y+ A+ m. RNA repressore I+ O+ Z+ Y+ A+ nessuna trascrizione RNA polimerasi

In presenza di lattosio I+ O+ Z+ Y+ A+ lattosio I+ O+ Z+ Y+ trascrizione RNA polimerasi A+

Riassumendo

Sintesi di -galattosidasi, permeasi e transacetilasi mutante Oc IIs I-d IQ ISQ Plac- induttore assente + + + - induttore presente + +* +* - * indotti da alte concentrazioni di lattosio

Le mutazioni I-d Nelle cellule aploidi le mutazioni I-d hanno fenotipo costitutivo. Nei diploidi parziali I+ /I-d le mutazioni I-d sono trans dominanti su I+ Il repressore è un tetramero La mutazione I-d produce una proteina alterata che nei diploidi parziali I+ /I-d si lega alle molecole buone di I impedendone il legame all’operatore Le mutazioni IQ e ISQ mutazioni a carico del promotore del gene I e determinano la produzione di un gran numero di molecole di repressore. Riducono l’efficienza di induzione e sono indotti solo da alte concentrazioni di lattosio

L’ ALLOSTERIA Tra l’altro, il lavoro genetico di Jacob e Monod permise di scoprire il fenomeno dell’allosteria Proteine che possiedono siti funzionali multipli che possono modificarsi in seguito a legami con substrati diversi

Analisi molecolare dell’operone Lac

Cosa succede se il glucosio e il lattosio sono presenti contemporaneamente? I geni lac. Z+, lac. Y+ e lac. A+ sono espressi solo se nel terreno non è presente il glucosio. Altrimenti il glucosio viene usato preferenzialmente anche in presenza di lattosio

Controllo positivo dell’operone lac in assenza di glucosio e in presenza di lattosio

Il glucosio mantiene basso il livello di c. AMP impedendo la formazione del complesso CAP-c. AMP