DNA polymr zloen z opakujcich sa jednotiek NUKLEOTID

DNA – polymér zložený z opakujúcich sa jednotiek NUKLEOTID Základná stavebná jednotka DNA

Nukleotid: 1. Dusíková báza – purín (adenín a guanín) – pyrimidín(cytozín a tymín – v DNA, uracil (namiesto tymínu – v RNA) 2. Cukor - (päťuhlíkový cukor) v DNA - 2 deoxyribóza v RNA - ribóza 3. Fosfátový zvyšok - H 3 PO 4

Dusíková báza V DNA sú : A, T, G a C V RNA sú : A, U, G a C

Cukor v RNA – D ribóza v DNA - 2 deoxy D ribóza

KOMPLEMENTARITA BÁZ

KOMPLEMENTARITA BÁZ

Polarita Reťazce DNA sú antiparalelné Antiparalelizmus DNA voľné 5’-PO 423’-OH konce 5´-koniec 3´-koniec : : : malý žliabok =deoxyribóza =fosfodieste- rová väzba : : : veľký žliabok : : : : : : 3´-koniec 5´-koniec

D N A 5´ 3´ Kódujúce vlákno (sense strand) 3´ 5´ Komplementárne vlákno (template strand)

Dvojzávitnica DNA

Pravo a ľavo - točivá DNA

B Z

Rôzne formy DNA

Úlohy DNA Schopnosť zachovať genetickú informáciu Odovzdať genetickú informáciu potomstvu (dcérske bunky) Vytvárať kópie – replikácia Schopnosť mutovať – evolúcia Realizuje sa genetická informácia - proteosyntéza

REPLIKÁCIA DNA Zdvojenie DNA Prenos genetickej informácie z rodičovských organizmov na potomstvo Vzhľadom na dĺžku DNA v bunke trvá niekoľko hodín ( živočíšna DNA sa zreplikuje asi za 8 hod s 2 chybami) Uskutočňuje na približne 400 miestach v jadre naraz

Semikonzervatívna = semidiskontinuálna materské reťazce dcérske reťazce ku každému z pôvodných vlákien DNA sa nasyntetizuje nové vlákno

Tvorba nového reťazca podľa pravidiel komplementarity C-G A-T

Fázy replikácie Iniciácia - začatie Elongácia - predlžovanie Terminácia - ukončenie

Topoizomeráza

helikázy – rozpletenie reťazcov

ssb proteíny – udržujú DNA v jednovláknovom stave ds. DNA-binding proteins 5' 3' ss. DNAbinding protein(s)

Iniciácia, začína v bode ORI U človeka je asi 100 000 miest dna A, B, C proteíny

Replikačná vidlica

Smer pohybu v replikačnej bubline

DNA polymeráza • hlavný enzým zodpovedný za predlžovanie reťazca DNA • chybovosť 1 / 107

Polymeráza má aj exonukleázovú aktivitu

DIMÉR Katalytické jadro polymerázy α + ε + θ β svorka- posúva sa za katalytickým jadrom a drží pohromade materský a dcérsky reťazec (sama sa nenapojí) γ komplex - nakladá β svorky na DNA v mieste, kde sú RNA primery

Orientácia DNA reťazcov vedúce vlákno oneskorené (zaostávajúce)vlákno

Primozóm = dna A, B, C proteíny + RNA primáza (tvorí primer) komplex 6 proteínov potrebných pre syntézu primeru (3 -6 nukleotidov) na 5´konci DNA vlákna Primáza - robí chyby, nemá exonukleázovú aktivitu (nevadí)

DNA ligáza – spájanie reťazcov

Iniciácia • RNA primer

Elongácia • DNA Polymeráza III

Iniciácia a funkčné elementy potrebné pre začatie replikácie eukaryotickej DNA ORC - origin recognition complex ORC

Doreplikovanie medzery = dokončenie syntézy dcérskych reťazcov Prebieha v telomérach, za pomoci TELOMERÁZY

GÉN základná funkčná genetická jednotka Gén predstavuje kompletnú sekvenciu nukleovej kyseliny (DNA alebo RNA), ktorá nesie informáciu pre syntézu určitého produktu (funkčnej RNA alebo proteínu). 1. Gén pre funkčnú RNA – DNA úseky - kódujú primárnu štruktúru r. RNA a t. RNA 2. Gén ako regulačná oblasť – úsek DNA alebo RNA (u RNA vírusov) – plní regulačnú funkciu. – rozpoznávaný špecif. proteínom – napojenie signalizuje zahájenie alebo zastavenie transkripcie – gén nemá produkt 3. Štruktúrny gén - úsek DNA – obsahuje informáciu o primárnej štruktúre proteínu

Centrálna dogma molekulovej biológie transkripcia translácia DNA ⇨ RNA ⇨ protein Watson a Crick 1959

Pozmenenie centrálnej dogmy molekulovej biológie Temin a Baltimore 1973 Reverzná transkriptáza

TRANSKRIPCIA Prepis genetickej informácie z DNA do m. RNA Prebieha v jadre

Prokaryoty majú len jeden druh RNA-polymerázy, ktorá katalyzuje syntézu RNA zo všetkých génov. Eukaryoty naopak používajú viacero typov RNA-polymeráz, ktoré zabezpečujú transkripciu z rôznych génových skupín.

Iniciácia Promótor rozpozná σ-faktor proteínová podjednotka RNA-polymerázy polymeráza začne odvíjať DNA - TATA box

Elongácia Transkripcia začína štartovacím kodónom ATG označuje sa +1. Pozícia na sekvencii DNA, ktorý sa nachádza pred týmto nukleotidom, má záporné číslovanie, 0 neexistuje Vytvára sa dočasný hybrid DNA - RNA sa oddeľuje od DNA

terminácia rho nezávislá rho závislá

Iniciácia transkripcie eukaryotických génov RNA polymeráza II potrebuje transkripčné faktory (evolučne konzervované), aby dokázala nasadnúť na promótor

Iniciácia transkripcie

Posttranskripčná úprava hn. RNA ⇨m. RNA 1. Vytvorenie čiapočky (cap) pred 5' UTR oblasť pripojí 5'-5' väzbou guanozín • chráni molekulu z tejto strany • uľahčuje jej naviazanie na ribozóm.

2. Vyštiepenie intrónov (splicing) Enzymaticky sa vystrihnú kópie intrónov a ligázou sa pospájajú exóny.

Splicing eukaryotického génu

Malé RNA človeka Druh malej RNA výskyt funkcia syntetizujúci enzým U 1 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U 2 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U 4 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U 5 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U 6 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza III U 7 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II histónovej hn. RNA U 11 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II U 12 sn. RNA jadro riadenie zostrihu RNA polymeráza II 7 SK sn. RNA jadro neznáma RNA polymeráza III 8 -2 sn. RNA jadro úprava pre-t. RNA polymeráza III U 3 sno. RNA jadierko úprava pre-t. RNA polymeráza II U 8 sno. RNA jadierko úprava pre-r. RNA polymeráza II U 13 sno. RNA jadierko neznáma RNA polymeráza II 7 SI sc. RNA cytoplazma translokácia proteínov RNA polymeráza III

3. Tvorba chvostíka ( 3' koniec) poly(A)polymeráza za 3' UTR nasyntetizuje 250 adenínov medzi každý 10 adenín sa včlení bielkovina m. RNA pre históny nemá poly. A chvost Funkcia: stabilizácia ochrana 3´ pred účinkom degradačných enzýmov

TRANSLÁCIA Preklad genetickej informácie z m. RNA do poradia AK Prebieha v cytoplazme na ribozómoch

16 S r. RNA

r. RNA sa syntetizuje v jadierku - RNA polymeráza I. NOR – oblasť organizácie jadierka Gény pre r. RNA – akrocentr. chromoz. D a G v oblasti satelitov Prekurzorová r. RNA 45 S + metylácia + bielkoviny = stabilita 45 S ⇨ 28 S , 18 S a 5, 8 S r. RNA Prechádzajú cez jadrové póry (20 nm) 5, 8 S 5 min 28 S 30 min

Small RNA genes 5 S r. RNA - RNA polymeráza III.

akceptorové rameno (bez slučky) - na jeho koniec sa viaže aminokyselina antikodónové rameno s antikodónovou slučkou - týmto koncom t. RNA rozoznáva genetický kód zapísaný v m. RNA pseudouridínové rameno s TΨC-slučkou - obsahuje modifikovaný uracil - pseudouracil dihydrouridínové rameno s D-slučkou- obsahuje modifikovaný uracil - dihydrouracil variabilná slučka - môže byť krátka alebo dlhá neovplyvňuje biologickú funkciu t. RNA

typ polymerázy výskyt funkcia RNA-polymeráza I jadierko transkribuje gény pre r. RNA-polymeráza II jadro transkribuje štruktúrne gény a gény pre niektoré malé RNA-polymeráza III jadro transkribuje gény pre t. RNA, 5 S-r. RNA a niektoré malé RNA

Fázy translácie Aktivácia aminokyselín – AK+t. RNA Iniciácia Elongácia Terminácia

Met t. RNA translačný komplex ternárny komplex prediniciačný komplex

Miesta na ribozóme A – aminokyselinové AK + t. RNA P – peptidové peptidyltransferáza E - odchod bielkovín R - odchod t. RNA

Terminácia Prok. termináciu riadia terminačné faktory RF 1 až RF 3. U eukar je uvoľňovací faktor e. RF rozpozná jeden zo STOP kodónov a uvoľní polypeptidový reťazec

Prokaryotická proteosyntéza Jadrová membrána Eukaryotická Neprítomná Prítomná Promótor GC-box (-90) CAAT-box (-80) TATA-box (Hognessov box) (-35) GACA box (-35) TATA box (Pribnowov box) (-10) RNA polymeráza Jedna Translácia iniciovaná Shine-Dalgarnov box Prvý kodón f. Met Polycistronická (viac génov) Gén 1 Gén 2 Gén 3 I. – III. 5’ cap Met Monocistronická (jeden gén) Gén dlhá m. RNA

Spôsoby získavania biologického materiálu • venepunkcia • biopsia • nekropsia • stery • filtrácia

SKLADOVANIE BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU • USKLADNENIE - krátkodobé (chladničky a mrazničky) suspenzné bakteriálne kultúry, bakt. na platni, tkanivové kultúry, vysušená DNA • ZÁLOHOVANIE - zlyhanie analýzy (mrazničky – 20 o. C) tkanivá, rozpustená DNA , enzýmy • ARCHIVÁCIA (hĺbkové mrazničky – 80 o. C, paraf. bločky tekutý dusík – 160 o. C ) - súdne lekárstvo - retrospektívna analýza - nové diagnostické metódy

HOMOGENIZÁCIA 1. mechanická ‑ trecie misky ‑ homogenizátor ‑ pretlačenie cez otvor 2. fyzikálna ‑ ultrasonikácia ‑ zmrazovanie a rozmrazovanie ‑ hypotonizácia 3. chemická ‑ detergenty ‑ enzymatické natrávenie

Restrikčné enzýmy Restrikčné endonukleázy, restriktázy Rozpoznávajú PALINDRÓM GAATTC CTTAAG štiepia špecificky 2 vláknovú DNA 5’ 3’ 3’ 5’

Štiepenie DNA restrikčnými enzýmami TUPÉ KONCE LEPIVÉ KONCE

Gélová elektroforéza Rýchlosť pohybu molekúl závisí od: • Rozmerov molekúl DNA Zmes DNA molekúl rozličných veľkostí Dlhšie molekuly Zdroj prúdu Gél Sklené platne Kratšie molekuly Gél po ukončení elektroforézy

Rýchlosť pohybu molekúl závisí od: • Koncentrácie gélu • Konformácie DNA • Veľkosti elektrického napätia • Zloženia roztokov • Teploty

Elektroforetická kontrola dobre vyizolovanej DNA

• po dokončení elfo sa veľkosti fragmentov DNA stanovujú pomocou fragmentov známej dĺžky - veľkostných štandardov

METÓDY MOLEKULOVEJ BIOLÓGIE A ICH VYUŽITIE PCR VNTR Sekvenovanie RFLP Fingerprint FISH

Polymerázová reťazová reakcia PCR skúmavky Teplotný cyklovač Na uskutočnenie PCR je treba mať: Reakčná zmes 1. templátová DNA 2. PCR primery 3. d. NTP 4. Taq polymeráza (150 nukl. /s) 5. reakčný roztok

1. Denaturácia teplom ( 94 -96ºC) C Y K 2. Naviazanie primerov (50 -65ºC) L U 3. Syntéza DNA ( 70 -72ºC) 4. Postup sa opakuje po 30 cykloch vzniká viac ako milión kópií S

VNTR - (variabilný počet tandemových opakovaní) pomocou PCR ATTGGA- motív 14 9 4 dĺžka úseku DNA „alela“ príslušného VNTR systému

Alely sa prenášajú z rodičov na deti (1 alela od otca a 1 od matky)

STR - Short Tandem Repeat Používa sa od 90 tych rokov vo foréznej medicíne. Metóda využíva variabilitu pri opakovaní krátkých sekvencií nukleotidov v určitých úsekoch DNA. Aby bola dosiahnutá vysoká rozlišovacia schopnosť, je vyšetrovaných viacej STR polymorfizmov zároveň.

Sekvenovanie DNA - určenie presného poradia nukleotidov v DNA 1. Sangerova metóda (r. 1975) 2. Maxamova-Gilbertova metóda (r. 1977) 3. Automatické sekvenátory (r. 1995)

Sangerova metóda sekvenovania Princípom - klasická PCR Ale! - pri syntéze dôjde k náhodnému zastaveniu dideoxyribonukleozidtrifosfáty – dd. ATP, dd. GTP, dd. CTP, dd. TTP - nemôže naviazať ďalší deoxyribonukleotid - vznikajú tak nedokončené úseky s rôznou dĺžkou - oddelenie pomocou elektroforézy

Fluorescenčná in situ hybridizácia

Typy sond pre FISH: 1. Centromerické

2. Génové (lokusovo špecifické)

3. Celochromozómové („paintingové“)

typy polymorfizmu DNA - majú odlišný molekulový základ bodový polymorfizmus (RFLP, Sekvenovanie) hypervariabilné oblasti DNA (RFLP, Fingerprint, VNTR, STR)

Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

1. izolácia DNA

2. štiepenie DNA jedným restrikčným enzýmom

3. Rozdelenie DNA fragmentov v elektroforéze Fragmenty v géli sú stále dvojvláknové

4. Denaturácia DNA fragmentov Chemická denaturácia - p. H 12 5. Neutralizácia Fragmenty zostanú jednovláknové 6. Southernov blotting Prenos fragmentov DNA z gélu na membránu (nylonová, nitrocelulózová) – kapilárna elevácia

6. Southernov blotting

7. Fixácia DNA v membráne Vákuová sušička 2 hod. pri 80 o. C 8. Príprava sondy Jednovláknový úsek DNA - rádioaktívne značená

9. Hybridizácia DNA zo spermií lososa

10. Autorádiografia a vyvolanie RTG filmu 11. Vyhodnotenie výsledkov

Kosáčiková anémia 146 AK v β-globínovom reťazci hemoglobínu substitučná mutácia – zámena adenínu za tymín v 6. AK: A : CCT GAG Pro Glu S : CCT GTG GAG Pro Val Glu

Kosáčiková anémia metódou RFLP A S

Fingerprint Prof. Alec Jeffreys - 1984

Prípad 1 1 2 3 5 6 7 8 9 Prípad 2 1 2 3 4

Možnosti využitia • Diagnostika genetických (monogénnych aj multifaktoriálnych) a nádorových ochorení • Génová terapia (genetických a nádorových ochorení) • Cielená liečba („molekulárna farmakológia“) • Štúdium biologických funkcií na molekulárnej úrovni (diferenciácia, starnutie. . . ) • Evolúcia človeka a pôvod ľudských populácií Podstatný krok - poznanie biológie nášho druhu!