KLINIKA VANOST DNA FRAGMENTACIJE SPERMIJA naa iskustva Marijan

KLINIČKA VAŽNOST DNA FRAGMENTACIJE SPERMIJA - naša iskustva Marijan Tandara Ana Bajić, Martina Šunj KBC Split

Povijesni pregled analize sjemena 1860 Prisutnost spermija/pokretni spermiji 1929 Prvi objavljeni rad o analizi sjemena u NEJM (Macomber) 1940 -tih Sjemeni parametri (Mac. Lead and Gold) 1944 Sistematska analiza sjemena (Hotchkiss) 1980 Morfologija spermija (Kruger and Menkveld) 1986 Objektivni biokemijski markeri sazrijevanja spermija i potencijala plodnosti (Huszar Lab)

1992. Palermo Uvođenjem ICSI-a izazvao revoluciju u rješavanju muškog faktora neplodnosti !

Parametri reproduktivnog uspjeha Jajna stanica 80% Uterus 10% Spermij 10% Modificirano - Danny Sakkas

50%

2000. Integritet kromatina spermija Ispitivanje DNA fragmentacije ?

Potencijalni uzroci DNA fragmentacije n Varikocela n Kemoterapija i radioterapija n Pušenje cigareta n Leukocitospermija (de Laminrande, 1993; Zini, 1995, Twigg, 1998; Iwasaki, 1992; (Saleh, 2003; Fischer, 2003; Zini, 2000) (Chatterjee, 2000; Deane, 2004; Kobayashi, 2001) (Mak, 2000; Kunzle, 2003; Potts, 1999, Sun, 1993) Zini, 1993) n Povećana tjelesna težina n Testikularna hipertermija (Kort 2006) (Sailer J 1997, Banks Reproduction 2005)

Etiologija oštećenja DNA spermija Intratestikularno Posttestikularno

Intratestikularno § Nedostatak protamina (nađen kod 5 -15% neplodnih muškaraca) De Yebra et al, J Biol Chem 1993; Bianchi et al, Biol Reprod 1993; Kramer et al, Genet Test 1997, Cho, 2003 § Poremećaj topoizomeraze II i tranzicijskih proteina Balhorn, J Cell Biol 1982; Kierzenbaum, Mol Reprod Dev 2001; Bissoneault, FEBS Lett 2002 § Apoptoza Sakkas et al, Exp Cell Res 1999, Sakkas et al. Reprod Biomed Online 2003

Posttestikularno VARIKOKELA LIJEKOVI PUŠENJE ZAGAĐENJE INFEKCIJA § prostate § sjemenih vezikula § epididimisa NEZRELI/ABNORMALNI SPERMIJI Lipidna peroksidacija KARCINOM Oksidativni stres DNA oštećenje Produženo zadržavanje spermija u epididimisu Apoptoza Oštećenje spermija NEPLODNOST Aitken et al, Biol Reprod 1998; Irvine et al, J Androl 2000

Određivanje integriteta DNA spermija u ispitivanju muške neplodnosti DIREKTNI TUNEL ( terminal deoxynucleotydil transferase-mediated deoxyuridin triphosphatenick-end labeling assay ) ( sd. SB ) ISNT ( in situ-nick translation ) Comet Assay ( neutral p. H – sd. SB ) INDIREKTNI ( zahtjeva denaturaciju DNA ) SCSA ( sperm chromatin structure assay ) Comet Assay ( acidic oder basischem p. H ) ( sd. SB ) SCD ( sperm chromatin dispersion test )

DFI% Parametri Normalni spermiogram DFI (%) >30% 24% DFI (%) <30% Lošim spermiogramom 29% Tandara M. i sur. 2012

Korelacija između DNA fragmentacije i sjemenih parametara Koncentracija Morfologija Pokretljivost Vitalnost * Spearman´s Rho r=-0, 18 r=-0, 32 r=-0, 41 r=-0, 36 p value p=0, 069 p=0, 001 p<0, 001 Tandara M. i sur.

Korelacija između DNA fragmentacije i sjemenih parametara Reference PARAMETRI koncentracija pokretljivost morfologija Kodama i sur (1997) 0, 49 Shen i sur (1999) 0, 24 0, 38 0, 42 Irvine i sur (2000) 0, 37 0, 54 Chan i sur (2001) 0, 38 0, 66 Tomlinson i sur (2001) 0, 24 Saleh i sur (2003) 0, 31 0, 04 0, 47 Larson-Cook i sur (2003) 0, 08 0, 18 0, 25 0, 20 A. Agarwal i sur; Human Reprod 2003

Deskriptivna statistika Variables Cijela grupa (n=206) Groupa 1 Groupa 2 DFI (%) 28 (24 -32) 25 (22 -28) 34 (30 -44) Koncentracija (× 106/ml) 27, 1± 14, 3 28, 2± 12, 3 25, 7± 16, 6 p=0, 374 Morfologija(%) 40, 7± 16, 7 44, 6± 14, 9 35, 5± 17, 7 p=0, 006 Pokretljivost(%) 28, 7± 18, 0 35, 2± 17, 0 20, 0± 15, 7 p<0, 0001 Vitalnost (%) 68, 1± 14, 6 72, 0± 11, 6 63, 0± 16, 4 p=0, 002 (n=57) Tandara M. i sur. (n=108) DFI<30% (n=98) DFI 30%

? ? Granična vrijednost DNA fragmentacije ? ?

Uspješnost trudnoće s obzirom na % DNA fragmentacije DNA fragmentacija Granična vrijednosti < 4% > 4% < 15% >15% < 18% >18% < 20% > 20% Trudnoće(%) 22. 7% 21. 4% 22. 8% 15. 4% 23. 2% 10. 0% 23. 8% 0. 0% M. Benchaib i sur. Human Reprod 2003

DNA fragmentacija § Da li visoka razina oštećenja DNA spermija pogađa fertilizaciju i razvoj embrija?

Ebner et al.

Korelacija kvalitete zametaka s DNA fragmentacijom DFI (%) Pearsonov koeficijent korelacije (r) p vrijednost ES (IVF/ICSI) - 0, 3865 0, 0199* *statistički značajno p< 0, 05 Tandara M i sur. 2012.

Tandara M i sur. 2012

Integritet DNA spermija postaje važan – ekspresija genoma embria blastocista 2 pronukleusa 2 st embrio 4 st embrio 8 st embrio

Analiza DNA fragmentacije…. …. je preporučljiva § Za pacijente sa više od 3 uzastopna IVF neuspjeha § U slučajevima kad je primijećen zastoj razvoja embrija § U slučaju ponavljanih pobačaja § U slučajevima neobjašnjene neplodnosti

IMSI PICSI

HVALA!