PROGRAMA DE PSGRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA DEPTO DE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA BIOLOGIA MOLECULAR Aula 7

REPLICAÇÃO DO DNA

DNA polimerases: enzimas que sintetizam DNA - Replicação do genoma: REPLICASES - Outras: REPARO e funções auxiliares na replicação - Procariotas: 3 DNA polimerases (DNA pol I, III) -Eucariotas: 5 polimerases ( , ß, , , ) - Mas, apenas UMA é a replicase

PROPRIEDADES das DNA pol - Sintetizam DNA a partir de moldes DNA - Necessitam de PRIMER - Mecanismo de síntese é similar - Síntese na direção 5’ > 3’ - Alta fidelidade - Atividade proofreading

Polimerização

Mecanismo de Polimerização

A REPLICAÇÃO É SEMI-CONSERVATIVA

A REPLICAÇÃO É BIDIRECIONAL

A REPLICAÇÃO É SEMI-DESCONTÍNUA

A Síntese de uma das cadeias é CONTÍNUA . . . 3’- ATGCTAGCTAGC AT 5’-UACGAUCGATCG CGA TA . . . 5’- TACGATCGATCGTA LEADING strand TA C G G T ATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! C TAGCTAGC

E A SÍNTESE DA OUTRA CADEIA? ? ? ?

A direção da síntese é SEMPRE 5’ > 3’ . . . 3’- ATGCTAGCTAGC AT 5’-UACGAUCGATCG CGA TA . . . 5’- TACGATCGATCGTA TA C G G T ATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! C TAGCTAGC

A Síntese da outra cadeia é DESCONTÍNUA . . . 3’- ATGCTAGCTAGC AT 5’-UACGAUCGATCG CGA TA G ATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! C A TAGCTAGC U A TC G C TA U A AGC. . . 5’- TACGATCGATCGT LAGGING strand

Síntese da LEADING strand . . . 3’- ATGCTAGCTAGC AT CG UACGAU AT . . . 5’- TACGATCGATCGTA AG TA C G ATCGATCG !!!!!!!!!!!!!!!!!!!! C TAGCTAGC T UMA ÚNICA INICIAÇÃO- PRIMER + ELONGAÇÃO

Síntese da LAGGING strand . . . 3’- ATGCTAGCTAGCATCGATAGAT ATCGTTTCGCGTCTATCTGCTGCTGCTCTTAT CT AG C TA G G A U UAGC. . . 5’- TACGATCGATCGTAGCTATC TA TC ATCGAT !!!!!!!!!!!! G TAGCTA A CU -Vários eventos de INICIAÇÃO e ELONGAÇÃO - Remoção dos PRIMERs - Ligação das cadeias – Fragmentos de OKAZAKI

REPLICAÇÃO SEMIDESCONTÍNUA (O filme)

REPLICAÇÃO EM PROCARIOTAS

DNA POLIMERASES em E. coli - DNA pol I – REPARO (tbém auxiliar na Replicação) - DNA pol II - REPARO - DNA pol III – É A REPLICASE!!!! - Apenas a I e III são ESSENCIAIS

PROPRIEDADES DAS DNA pol de E. coli I II III -Polimerização 5’>3’ + + + -Atividade exonuclease -3’>5’ + + + -5’>3’ + - - -Taxa de síntese por seg 600 , 30. 000 -Moléculas por célula 400 , 10 -20

“PROOFREADING” (3’ > 5’ EXONUCLEASE)

DNA pol I (E. coli) Primeira DNA pol caracterizada Polipeptídeo único: 104 k. Da Clivagem gera dois produtos: 68 k. Da e 35 k. Da Klenow fragment (68 k. Da): polimerase, exo 3’ > 5’ Fragmento de 35 k. Da: atividade 5’ > 3’ exonuclease Capaz de iniciar a síntese em “NICKs”(única) Funções – -Reparo (Nick translation) -Termina a síntese da “lagging strand”

NICK TRANSLATION

DNA pol III (Replicase de E. coli) Complexo enzimático (várias subunidades) Atividade polimerase e 3’ > 5’ exonuclease Síntese da leading e lagging strands Fidelidade: 10 -8 - 10 -10 (1 erro/genoma/1000 ciclos) Proofreading- aumenta fidelidade 10 a 200 vezes Síntese: 800 a 1000 nt/s

ETAPAS da REPLICAÇÃO 1. INICIAÇÃO Primossoma 2. ELONGAÇÃO Replissoma 3. TERMINAÇÃO/SEGREGAÇÃO

REPLICON: A UNIDADE DE REPLICAÇÃO Inicia na ORIGEM - termina no TERminador BACTÉRIAS: um ÚNICO REPLICON (4. 000 kb) REPLICAÇÃO: 46’ ORI: 245 bp Contém 3 (13 bp repeats), 4 (9 bp repeats) Sítios p/ ligação da proteína Dna. A

ORIgem em E. coli -245 bp -Três 13 mer repeats - Quatro 9 mer repeats

Pré-INICIAÇÃO em E. coli -Dna. A liga-se nos 9 mer - Multimerização da Dna. A Forma agregados e flexionam O DNA Separação das cadeias Inicia nos 13 mers -Dna. B+Dna. C juntam-se Ao complexo e formam o Complexo de iniciação -Dna. B – helicase -Dna. C- liga-se na Dna. B

FUNÇÕES NO REPLICATION FORK Função E. coli Helicase Dna. B Primase Dna. G Clamp subunit Catálise Pol III Remoção do Primer E substituição por DNA Pol I Ligação dos Okazaki Ligase

Helicase Primase DNApol III SSB DNApol I

REPLICAÇÃO EM EUCARIOTAS

EUCARIOTAS Múltiplos REPLICONS YEAST (40 kb), mamíferos (100 kb) ORI? Terminador? Iniciam na fase S Síntese (2000 bp/min x 50. 000/min em E. coli) Síntese não é simultânea Replicação completa em 6 horas

DNA pol de EUCARIOTAS Pol - Primase (síntese dos primers RNA) Ld & Lg Pol - Reparo Pol - Replicase (Ld & Lg) Pol - Replicação do DNA mitocondrial Pol - Reparo

PROPRIEDADES DAS DNA POL de EUCARIOTAS -Polimerização 5’>3’ + + + -Atividade exo 3’>5’ - - + + + -Atividade PRIMASE + - - - Localização N M N N N

FUNÇÕES NO REPLICATION FORK Função E. coli Hela cells Helicase Dna. B ? Primase Dna. G Pol alfa/primase Clamp subunit PCNA Catálise Pol III Pol Remoção do Primer Pol I MF 1 Ligação dos Okazaki Ligase I

As DNA pol PRECISAM de Primer!!!! PRIMERS utilizados pelas DNA Pol Primer de RNA (replicação procariotas/eucariotas) O próprio DNA-OH (reparo, alguns vírus) Proteína (alguns vírus)

Primer de RNA (replicação Euc + Proc) Primer de DNA Nick + parvovírus Proteína -0 H - Adenovírus

MUTAÇÕES (definição) Origem: 1. Erros da Polimerase durante a REPLICAÇÃO 2. Erros da Polimerase durante o REPARO 3. Lesões (cross-link) durante a interfase Mutações em ponto, deleções e inserções Podem ter efeitos diversos, dep. do tipo, da célula e do local Em células somáticas: podem levar a neoplasias!

MUTAÇÕES EM PONTO: 1. De acordo com a troca de base: Transições ou Transversões 2. De acordo com o efeito: - Silenciosa (mesmo a. a) - “Missense” (a. a. diferente) - “Nonsense” (stop codon) Não altera a fase de leitura 2. Inserção 3. Deleção Alteram a fase de leitura (frameshift)

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