PROGRAMA DE PSGRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA DEPTO DE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA DEPTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA BIOLOGIA MOLECULAR Aula 6

DNA atgagagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctacgtcgtagctacgtagc tactctgagatgctacgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcta Transcrição Transcrito primario 5`ucuguaugucaaugucugaagcuaucu-3` RNAm, RNAt, RNAr, sn. RNAs

O GENE Start point Promotor Terminador Região transcrita atgagagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctacgtcgtagctacgtagc …………………………………………………………… tactctgagatgctacgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcta DNA Transcrição RNA ucuguaugucaaugucugaagcuaucu

TRANSCRIÇÃO EM PROCARIOTAS

RNApolimerase -Complexo de subunidades -Sintetiza todos os RNAs -7000 cópias/célula -Core + fator sigma = Holoenzima (465 k. Da)

O PROMOTER PROCARIOTA Iniciador Terminador Região transcrita atgagagctagctagcatcgatcatgctagcatcgtagctagctacgtcgtagctacgtagc …………………………………………………………… tactctgagatgctacgatcgatgctagcatcgtacgatgcatgcatgcta Promoter PRIBNOW BOX TATA BOX

E. coli possui diferentes fatores SIGMA Função: reconhecimento dos diferentes promotores

Etapas da Transcrição 1. Reconhecimento/ligação ao promotor 2. Separação das cadeias de DNA 3. Iniciação da polimerização 4. Elongação (polimerização) 5. Terminação INICIAÇÃO

-DNA é separado (bolha de transcrição) -Velocidade: 40 nt/seg - Movimento da RNA Pol gera tensão adiante E relaxamento atrás - Girase/ topoisomerase Corrigem estas distorções

Direção da síntese 5’ > 3’

TERMINAÇÃO Dois modos: -Terminadores intrinsecos (+) -Terminators Rho-dependent (-)

A MAIORIA DOS m. RNAs PROCARIOTAS SÃO POLICISTRÔNICOS CISTRON = GENE

RNA monocistrônico AUG 5’ STOP ORF Leader 3’ Tradução Trailer Proteína Em bactérias, são uma minoria!

RNA policistrônico Região Intergênica (-1 a 40 nt) AUG 5’ Leader ORF-1 STOP AUG ORF-2 STOP 3’ Tradução Proteína 1 Trailer Proteína 2 Em bactérias, são uma maioria! Geralmente codificam produtos c/ função relacionada

Transcrição e Tradução simultâneos DEGRADAÇÃO ocorre CONCOMITANTE/ Meia-vida: seg-min

Degradação do m. RNA Duas etapas - Clivagem (RNAse E) - Degradação terminal (exonuclease)

TRANSCRIÇÃO EM EUCARIOTAS

TRÊS RNA POLIMERASES (RNApol) - RNApol I - r. RNA(nucléolo) - é a mais abundante - RNApol II - m. RNA(nucleoplasma) - RNApol III – t. RNA + sn. RNAs (nucleoplasma) (-) - Reconhecem promotores diferentes - RNApol I e II – geralmente upstream - RNApol III – alguns promotores downstream -Necessitam vários fatores de transcrição (TFs) para iniciação (reconhecimento dos promotores)

RNApol II - Complexo enzimático (8 - 14 subunid. ) > 500 k. Da - Possui atividade polimerase, mas é incapaz de reconhecer /ligar no promoter e iniciar a transcrição - Subunidade maior: contém a cauda CTD (7 aa [YSPTSPS] 26 – 50 -Fosforilação do CTD: regulação do início da transcrição - Dois complexos enzimáticos: - Iniciação; - Elongação

PROMOTER BÁSICO - Existe em virtualmente todos os genes - Permite níveis basais de transcrição - Start point: Inr (geralmente Py 2 CAPy 5)

A Maioria dos PROMOTORES EUCARIOTAS possui outras sequências regulatórias

Iniciação da Transcrição

Formação do Complexo de iniciação - TFIID (TBP + TAFs) -TAFs: ~ 20 - RNApol: ~10 sub -Total: >1000 k. Da

Formação do Complexo de iniciação

OUTRAS SEQUÊNCIAS REGULATÓRIAS - Locais de ligação dos TFs

PROMOTERS E ENHANCERS

PROMOTERS - Localizados próximos (distância fixa) do startpoint (<200 nt) - Posição (distância) e orientação são críticos - Geralmente upstream - São sítios de ligação de TFs -São essenciais para transcrição basal

ENHANCERS - Podem estar longe (vários kb do startpoint) - Upstream ou downstream - Posição e orientação não são críticos - Sítios de ligação de TFs (< 100 bp) - Aumentam a eficiência de transcrição a partir do Promoter - Não são essenciais para a transcrição basal

FATORES DE TRANSCRIÇÃO (TFs) General factors - são necessários para iniciação em todos os promoters. Formam com a RNApol II o complexo basal de transcrição. Upstream factors - reconhecem pequenas sequências (sítios)upstream. Atuam em qualquer promoter que tenha esses sítios, constitutivamente. Aumentam a eficiência da transcrição. Fatores induzíveis- Funcionam similar aos upstream, mas tem papel regulador. São ativados ou sintetizados em tecidos específicos ou em tempos específicos. São responsáveis pela regulação da expressão gênica no tempo e no espaço (diferentes tecidos).

COMO OS ENHANCERS EXERCEM FUNÇÃO NA TRANSCRIÇÃO À DIST NCIA? ? ?

Iniciação da Transcrição Complexo de iniciação

Início da transcrição - TFIIH possui atividades ATPase, helicase, quinase -Fosforilação da CTD da RNApol determina o Início da transcrição -A fosforilação resulta na Dissociação dos TFs - A maioria dos TFs é liberada antes do início Da transcrição

ELONGAÇÃO

3’ CH 2 OH A T OH 0 -P C OH 0 -P T 5’

Direção da síntese 5’ > 3’

Terminação -Mecanismo pouco conhecido - RNApol. II passa do final do gene - 3’ end é gerado por clivagem - Adição de poli. A

Modificação do transcrito primário (em m. RNA) -5’ CAP - Clivagem 3’ - Cauda poli. AAAAAAA -Splicing e exportação

5’ CAP

Cauda poli. A 5’-augcuacgaucgaucgaucgcau. AAAAA(até 200) - Sintetizada logo após o fim da transcrição - Poly-A – polimerase - Poly. AAA associa-se a PABP (múltiplas cópias) - Virtualmente todos os m. RNA vindos do núcleo tem poli. A -Função - Estabilidade para o RNAm (PABP) - Necessário p/ tradução (PABP tbém) - Necessário p/exportação (? ) - Usos

A maioria dos genes eucariotas é descontínua

Exons e íntrons Média: 7 – 8 exons Exons: 100 -200 bp Introns: ~ 1 -2 kb Remoção dos Introns m. RNA Splicing

RNA catalítico: RIBOZIMA

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