OCENA STANU ODPORNOCI OWADW Marek Chmielewski ODPORNO Wrodzona

OCENA STANU ODPORNOŚCI OWADÓW Marek Chmielewski

ODPORNOŚĆ • Wrodzona lub nabyta niewrażliwość, względnie zmniejszona podatność organizmu, na czynniki szkodliwe identyfikowane jako „nie własne” (non-self), uwarunkowana genetyczną konstytucją ustroju oraz szeregiem mechanizmów obronnych natury komórkowej i humoralnej.

ODPORNOŚĆ PRZECIWZAKAŹNA • organizmu na choroby wywołane przez drobnoustroje. Odczyny obronne powodują likwidację, unieszkodliwienie lub zniszczenie patogenu. • W rozważaniach nad odpornością bezkręgowców, obydwie definicje są wykorzystywane, niekiedy wzajemnie się uzupełniają.

MECHANIZMY WSPÓLNE DLA WIELU GRUP ZWIERZĄT • • • Rozpoznanie self or non self Fagocytoza Aktywność bakteriobójcza enzymów lizosomalnych fagocytów • Aktywnośc typu lizozymu lub lysozymelike • Obecność substancji przekaźnikowych (cytokiny, chemokiny)

CHARAKTERYSTYKA ODPORNOŚCI BEZKRĘGOWCÓW • nie jest związana z limfocytami B, T i Ig • baza materialna (immunocyty, ciało tłuszczowe) • pojawia się szybko (godziny, dni) • trwa krótko • odporność nabyta nie występuje u wszystkich grup • wyjątkowo cechuje się swoistością • z reguły brak pamięci immunologicznej

MECHANIZMY ODPORNOŚCI BEZKRĘGOWCÓW wspólne dla wszystkich grup charakterystyczne dla większości bezkręgowców charakterystyczne dla typu lub gromady bezkręgowców

W wyniku: Ø zakażeń wirusowych i bakteryjnych Ø inwazji pasożytniczych Ø pod wpływem stresu (temperaturowy, pokarmowy, socjobiologiczny) ulega zaburzeniu odporność wewnętrzna owadów uwarunkowana działaniem humoralnych i komórkowych mechanizmów odporności. Zaburzenia odporności mogą zostać spowodowane również: Ø stosowaniem pewnych leków Ø nieodpowiednimi sposobami ich aplikacji

ODPORNOŚĆ PRZECIWZAKAZNA Fizjologiczna (wrodzona) 1. Przeciwzakaźne bariery anatomicznofizjologiczne 2. Odporność sekrecyjna 3. Odporność behawioralna 4. Mechanizmy odporności wewnętrznej Nabyta (indukowana) Cekropiny Attacyny Cecropin likesubstances Apidycyny Abacyna

PRZECIWZAKAŹNE BARIERY ANATOMICZNO-FIZJOLOGICZNE § Okrywa ciała § Układ tchawkowy § Bariery przeciwzakaźne przewodu pokarmowego § Mechanizmy odporności przeciwzakaźnej przedżołądka § Mechanizmy środowiska biochemicznego jelita środkowego § Antybioza i kompetycja bakteryjna § Błona perytroficzna jelita § Ściana jelita środkowego

Odporność sekrecyjna v Mleczko pszczele v Kit pszczeli (propolis) v Układ antybiotyczny miodu v Układ antybiotyczny nektaru v Układ antybiotyczny pyłku Odporność behawioralna v Wykrywanie chorych i martwych osobników, usuwanie z ula, czyszczenie plastrów (hygenic behaviour) 2 recesywne geny v Oczyszczanie (cleanining behaviour) – samooczyszczania (self cleaning), taniec oczyszczający (grooming dance) i oczyszczania grupowe (group cleaning) v Rójka v Mechanizmy chrponiące czerw przed zakażeniem

Mechanizmy odporności wewnętrznej KOMÓRKOWE HUMORALNE FAGOCYTOZA Lizozym INKAPSULACJA Układ fenylooksydazy NODULACJA Lektyny Humoralna inkapsulacja Aktywność zbliżona do dopełniacza KOAGULACJA HEMOLIMFY MELANIZACJA KRWI

Lizozym • Muramidaza, N acetylomuramylhydrolaza (EC. 3. 2. 1. 1. 7) eznym rozkładający wiązania endo beta (1— 4) pomiędzy kwasem N acetylomuraminowym i N acetyloglu kozaminą ściany komórkowej bakterii gram dodatnich. • Lizozym jest białkiem zasadowym o punkcie izoelektrycznym 10, 5— 1, 0 i ma sie cząsteczkowej około 15 000 stabilnym w kwaśnym p. H w wyższych temnpratu rach, a ulegającym inaktywacji w zasadowym p. H.

Lizozym • Powoduje on lizę zawiesiny Micrococcus lysodeikticus z następowym uwalnianiem cukrów redukujących i aminokwasów. • Enzym ten działa przeciwbakteryjnie na bakterie gram dodatnie takie jak: M. lysodeikticus, Sarcina lutea i Bacillus subtilis

Lizozym • Fizjologiczny poziom lizozymu wynosi w hemolimfie larw Apis mellifera od 5, 0 do 10, 0 (ug/ml) poczwarek i imago od 5, 0 do 25, 0 ug/ml). Ten niski wrodzony poziom lizozymu wzrasta kilkakrotnie po zakażeniach i pod wpływem działania stresu, osiągając maksymalne wartości po 24 -48 godzinach.

Lizozym • Uważa się, że u owadów lizozym jest jednym z głównych czynników odporności humoralnej o działaniu bakteriobójczym. Jest on syntetyzowany de novo w ciele tłuszczowym. U owadów holometabolicznych lizozym współdziała z cekropinami i atacynami w likwidacji zakażeń bakteryjnych. Ze względu na fakt, że poziom lizozymu jest pewnym odzwierciedleniem stanu odporności humoralnej owadów, określanie jego aktywności jest wykorzystywane w ocenie stanu odporności.

Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Próbki hemolimfy (5 ug) dodaje się do 25 ug płynu fizjologicznego zawiera jącego kryształek fenylotiomocznika, a następnie wkrapla się do baseników wyciętych w żelu agarozowym w ilości 7, 5 ug.

Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Żel sporządza się dodając do 9 ml buforu Sorensena (0, 062 M, p. H 6, 4) zawiesinę o składzie: 1 ml buforu Sorensena, 75 mg zliofilizowanych komórek Micrococcus lysodeikticus i 300 mg oxytetracykliny, dokładnie roztartą.

Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Następnie do tak uzyskanego roztworu, po ogrzaniu dodaje się 0, 1 g agarozy i wylewa na płytki (grubość żelu 2, 5— 3, 0 mm). Po zestaleniu żelu wycina się baseniki o pojemności 7, 5 µg. Płytki z wypełnionymi basenikami inkubuje się w 28°C przez 24 godziny.

Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Aktywność lizozymu ocenia się z krzywej regresji na podstawie wielkości strefy przejaśnienia (bakteriolizy) mnożąc uzyskane wyniki przez 6 (współczynnik rozcieńczenia hemolimfy).

Określanie aktywności lizozymu metodą biologiczną • Krzywą regresji sporządza się dla następujących stężeń lizozymu: 15, 62; 7, 81; 3, 9; 1, 8; 0, 9; 0, 45; 0, 22 (yg lizozymu białka jaja kurzego/ /mililitr), odcinając na osi x stężenie lizozymu w µg/ml zaś na osi y średnią strefy bakteriolizy w milimetrach.

Hemolimfa Złożona z osocza i hemocytów nie bierze udziału w wymianie gazowej: n Rezerwuar wody n Środek transportu dla składników pokarmowych i produktów przemiany materii n Hormonu i enzymy n Działa buforująco n Warunkuje turgor ciała, n procesy krzepnięcia krwi i reparacji ran n Odtoksycznia wiele związków biologicznie czynnych

Hemolimfa n Jest środowiskiem dla hemocytów, polipeptydów i białek odpowiedzialnych za odporność komórkową i humoralną

Hemolimfa Stanowi od 25 do 30 % masy ciała, np. . 116 µl u poczwarki robotnic z brązowymi oczami i 160 ml u poczwarki trutnia, 30 – 40 µl u świeżo wygryzionych pszczół, 19 u pszczół ulowych i 16 µl u zbieraczek. n Ciężar właściwy: Robotnica 1, 038 – 1, 045 Truteń 1, 050 Matka 1, 051 n

Hemolimfa Odczyn zbliżony do obojętnego : Czerw – 6, 77 do 6, 93 Imago – 6, 7 Zdolność buforująca bardzo niska nieznacznie przekracza zdolność buforyjącą wody

Hemolimfa Zmienny skład w zależności od: n Wieku, n Grupy osobniczej (kasty) n Płci n Stadium rozwojego n Diety n Głodzenia

Hemolimfa Profil białek hemolimfy THC Zdrowie choroba DHC Egzoproteinazy bakteryjne Egzoproteinazy pasożytnicze Leki

Hemolimfa - pobieranie n n n Czerw (larwy)– ostrożnie wyjąć z komórki plastra, położyć na szkiełko podstawowe, naciąć naskórek (np. b. cienka igła) i pobierać mikropipetą Przedpoczwarki, poczwarki i dorosłe – dekapitacja i lekkie uciśnięcie tułowia Poczwarki i imago – zatoka grzbietowa, między 3 a 4 tergitem odwłoka po stronie grzbietowej

Hemolimfa - rozmaz n n Po pobraniu do kapilary przenosi się na szkiełko podstawowe Rozmaz krawędzią nakrywkowego Schnie w temperaturze pokojowej Szkiełka odtłuszczane w mieszaninie 96% etanolu i eteru do narkozy (1: 1)

Hemolimfa - barwienie n n n Wyschnięty preparat zalewa się 2 -3 ml barwnika Wrighta na 1 minutę Dodaje się identyczną objętość buforu fosforanowego (KH 2 PO 4 – 3, 315 g, Na HPO – 1, 28 g, woda destylowana – 500, 00 ml, miesza się do pojawienia się metalicznego połysku na powierzchni barwnika z buforem Po 2 -3 minutach od dodania buforu powierzchnię preparatu zmywa się szybko wodą bieżącą Uwaga! Nadmierne zmywanie odbarwia preparat Wysuszyć i oglądać pod imersją przy pow. co najmniej 700 x.

Hemocyty n n n Wywodzą się z mezodermy zarodka Równowaga pomiędzy pojawianiem się nowych i zamieraniem starych Równowaga pomiędzy hemocytami krążącymi a osiadłymi senssile haemocytes)

Hemocyty n n n Wywodzą się z komórki pnia (stem cell) prohemocytu (podstawowa komórka hemolimfy) Prohemocyty skupione wzdłuż przedniego odcinka grzbietowego naczynia krwionośnego wykształcają plazmatocyty i (? ) komórki sferyczne Rozplem i diferencjacja hemocytów w hemolimfie głównie przez podziały mitotyczne związane z rozowojem osobniczym, tuż przed kolejną zmianą stadium wzrosta THC (obserwowane również u imago)

Hemocyty Układ endokrynalny owada (głównie ekdyson) Wzajemne stosunki pomiędzy typami hemocytów Wielkość indeksu mitotycznego Przechodzenie z narządów hemopoetycznych do hemolimfy Mobilizacja komórek osiadłych

Hemocyty – Ciało tłuszczowe n n n Pochodzenia mezodermalnego Wielkość zmienna wraz z rozwojem larwalnym – najwięcej komórek u larw 2 – 3 dniowych U pszczoły dorosłej jest cienką warstewka wyściełającą od wewnątrz ścianę odwłoka(zatoka krwionośna grzbietowa i brzuszna)

Hemocyty – Ciało tłuszczowe prohemocyt plazmatocyt Komórka sferyczna Komorka ziarnista cystosyt

Hemocyty - identyfikacja Klasyfikacje: n Jonesa (1962) – 9 typów hemocytów n Ville i Vecchi (1966) - 8 typów n Gilliam i Shimanuki (1971) – 7 typów obecnych w hemolimfie i 2 typy komórek pnia – enocyty i komórki perikardialne

PROLEUKOCYT 3, 4 - 6, 0 µ Jądro: jasnoniebieskie Cytoplazma: niebieska

Neutrofil 3, 0 – 7, 0 µ Jadro: ciemnoniebieskie ziarniste Cytoplazma: niewidoczna

Eozynofil 3, 0 – 6, 0 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: jasnoróżowa

Bazofil 2, 0 – 4, 5 µ Jądro: ciemnopurpurowa Cytoplazma: praktycznie niewidoczna

Leukocyt normalny 3, 0 – 7, 0 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: niebieska

Pyknoleukocyt 12 -18 x 2, 5 - 7, 5 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: lekko różowa

Hialinocyt 7 – 11 x 3, 5 – 7, 0 µ Jądro: ciemnoczerwone ziarniste Cytoplazma: lekko różowa

Reakcje między komórkami immunoreaktywnymi Owady – hemokiny przekaźnikami informacji między immunocytami n TNF (czynnik martwicy nowotworów – reguluje niekóre odczyny immunologiczne n TNF wspólnie z gallizyną 2 kontroluje utrzymanie integralności ciała owada (wzrost, zranienia) n Ø Ø Gallizyna 2 wraz z plazmatocytami współdziała: w fagocytowaniu uszkodzonych komórek ciała w gojeniu ran i tworzeniu nowych tkanek

Model aktywności hemokin owada Odczyny komórkowe 1. Adherencja 2. 2. Fagocytoza 3. Nodulacja zakażenie hemocyty Aktywowane hemocyty Aktywność 1. Lizozymu 2. Układu oksydazy polifenolowej Regulacja Kontrola nowotworzenia Przebudowa tkanek Uszkadzanie komórek HEMOKINY Ciało tłuszczowe Po; ipeptydy i białka bakteriobójcze

Rola hemocyta ziarnistego owada Apidycyny Lizozym bakteriocydia Fagocytoza Nodulacja i inkapsulacja Koagulogeny Krzepnięcie hemolimfy Profenylooksyda za Lektyny rozpoznawanie

Fagocytoza • Fagocytoza jest to proces, polegający na pochłanianiu, niszczeniu lub sekwestracji substancji obcych dla: organizmu owada, które przedostały się do jego hemocelu. U owadów przebiega ona w kilku etapach: chemotaksja, adherencja, pochłanianie i trawienie.

Fagocytoza • Stanowi ona jeden z głównych mechanizmów komórkowego ramienia odporności owadów, w którym zaangażowane są wyspecjalizowane komórki krwi owadów.

Fagocytoza-Typy hemocytów zaangażowane w reakcjach odpornościowych Odporność komórkowa Plazmatocyty Koagulacja Trefocytoza 0 dkładanie substancji obcych, transport produktów krwi przemiany materii, odtoksycznianie związków biologicznie czynnych Cystocyty Adipohemocyty podocyty Prohemocyty Hemocyty ziarniste Adipohemocyty

Fagocytoza • Fagocytoza ulega zwiększeniu w początkowych fazach zakażenia, wybitnie spada w niektórych inwazjach pasożytniczych, np. w przebiegu warozy. • Wgląd w aktywność fagocytarną hemocytów daje indeks fagocytarny, który wskazuje na średnią liczbę bakterii pochłoniętych przez 1 hemocyt obdarzony zdolnością fagocytarną. Określanie wartości indeksu fagocytarnego wykorzystuje się powszechnie w ocenie efektywności komórkowego ramienia odporności owadów.

Fagocytoza Najstarszy filogenetycznie mechanizm obronny reprezentowany przez wyspecjalizowane komórki krwi i niektóre komórki osiadłe - fagocyty n wychwytywanie n niszczenie obcych materiałów

Fagocytoza U owadów wyróżniono cztery typy reakcji fagocytarnych (Metalnikow i Chorine, 1929) 1. calkowity brak lub słabą fagocytoze (f. nieefektywna jako odczyn obronny) 2. fagocytoza tylko w początkowym okresie zakażenia i jej stopniowe zanikanie 3. Brak f. na początku zakażenia i jej stopniowy rozwój w miarę postępów zakażenia 4. Silna i efektywną f. na takim samym poziomie przez cały okres zakażenia

Fagocytoza u pszczół n n n Plazmatocyty Hemocyty ziarniste (granulocyty) Fagocytozę u A. mellifera wspomaga nodulacja i inkapsulacja „intensywana” współpraca z humoralnymi odczynami obronnymi prowadząca do oczyszczenia hemocelu (clearance) z drobnoutsrojów (przede wszystkim bakterii) Skuteczna w zakażeniach bakteryjnych do momentu przekroczenia charakterystycznych ilośći bakterii dla danej postaci rozwojowej (lub gatunku owada). Dla pszczoły nie przekracza zapewne 1000 komórek/µl hemolimfy

Określanie wartości indeksu fagocytarnego • Do probówki Eppendorfa lub silikonowanej probówki szklanej pobiera się około 5 µl krwi czerwia lub pszczoły. Krew od czerwia uzyskuje się poprzez nakłucie pipetą miarową oskórka, natomiast od pszczoły z zatoki okołosercowej.

Określanie wartości indeksu fagocytarnego • Następnie dodaje się do probówki identyczną objętości 18 godzinnej hodowli bulionowej komórek Sarcina lutea przemytej 2— 3 razy jałowym płynem fizjologicznym o końcowym stężeniu ok. 3 x 105 komórek/ml. Mieszaninę wstawia się na 15— 30 minut do termostatu o temperaturze 22— 24°C, okresowo wstrząsając.

Określanie wartości indeksu fagocytarnego • Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym sporządza się gruby rozmaz i barwi go po wyschnięciu błękitem metylenowym lub fuksyną zasadową przez okres 15— 20 minut.

Określanie wartości indeksu fagocytarnego • Preparat ogląda się pod obiektywem immersyjnym i oblicza się ilość pochłoniętych komórek S. lutea przez 50 hemocytów. • Z tych danych oblicza się średnią ilość bakterii pochłoniętą przez 1 hemocyt (indeks fagocytarny).

Nodulacja n n Przekroczenie granicznej „pojemności” fagocytozy uruchamia nodulację, bardziej złożony proces komórkowy wspomagający fagocytozę. W najprostszej formie: otoczenie fagocytujących (albo już rozpadłych hemocytów kilkoma warstwami komórek krwi z równoczesnym odłożeniem melaniny

Nodulacja Typowy guzek składa się z: W centrum n Z ziarnistych nieuszkodzonych lub/i zabitych hemocytów n Skupisk bakterii n Matrixu n Melaniny Na zewnątrz: n Kilka warstw spłaszczonych hemocytów Stanowi to dobra izolację bakterii od hemolimfy owada

Nodulacja n n Guzki unoszone są z prądem krwi Guzki osadzają się na powierzchni narządów zewnętrznych owada Otaczane są twory o wymiarach poniżej 10 µm Im zjadliwsze bakterie tym guzki większe a czas ich tworzenia krótszy

Nodulacja Proces wielostopniowy: Bezpośredni kontakt subst. obcej z ziarnistym hemocytem aktywuje hemocyt powodując degranulację ziarnistości cytoplazmatycznych Zaktywowany hemocyt wydziela substancje hemotaktyczne przyciągające plazmatocyty (ew. inne kom. krwi) w okolicę aktywnego hemocyta. Zwiększa się adhezyjność Skupiska fagocytujących hemocytów, rozpadłych hemocytów, agregatów bakterii, uwolnionych składników cytoplazmy hemocytów Melanizacja guzka jest następstwem aktywacji układu oksydazy polifenolowej przez produkty rozpadu aktywnych w nodulacji hemocytów

Nodulacja u pszczoły miodnej n n n Wspomaga fagocytoze przy sepsach bakteryjnych w jamie ciała Nodulowane bywają spory Nosema apis Niewykluczona nodulacja zarodników niektórych grzybów

Inkapsulacja Tworzenie otoczki jest komórkowym rzadziej humoralnym odczynem obronnym n Komórkowa: n Gdy cząstka substancji obcej za duża do sfagocytowania, powstaje otoczka z kilku a nawet kilkudziesięciu hemocytów Z reguły o średnicy większej niż 10 µm

• Inkapsulacja Z reguły o średnicy większej niż 10 µm Konidia, Strzepki grzybów Pasożyty i ich jaja Większe skupiska bakterii Upostaciowane większe twory W inkapsulacji humoralnej otoczkę tworzy wartswa melaniny

Inkapsulacja Dwa typy otoczek: Typu ribesia – wiele warstw hemocytów bez melanizacji lub jest m. słaba Typu balteata – jedynie kilka warstw hemocytów ale jest silnie zmelanizowana

Inkapsulacja Dotyczy najczęściej pasożytów i przejawia się : 1. brak odczynu obronnego, przy b. dobrej adaptacji pasożyta do gospodarza (pasożyt rozwija się w jamie ciała gospodarza) 2. Brak reakcji hemocytarnej, ale z z osłabieniem lub zahamowanie wzrostu pasożyta 3. Odczynom komórkowych ulegają wyłącznie osłabione i martwe pasożyty 4. Odczyn obronny ograniczony do określonego stadium rozwojowego pasożyta 5. Dotyczy żywych pasożytów i polega na tworzeniu nacieków hemocytarnych w niektórych miejscach ciała pasożyta 6. Powstawanie typowych otoczek zarówno wokół żywych (pasożyty, skupiska bakterii jak i martwych (zabite jaja, znekrotyzowane pasożyty) obiektów

Inkaspulacja u pszczoły Dotyczy: n Zarodników mikrosporidiów (N. apis) n Hurmaczków n Niekiedy wiciowców (Leptomonas apis) Przy niewielkim porażeniu z reguły skuteczna

Krzepnięcie krwi i gojenie ran Przyczyny urazów: v Mechaniczne v Ataki pasożytów zewnętrznych (V. destructor) v Inwazje pasożytów wewnętrznych Nosema apis, v Leptomonas apis, Leidyana apis, Epigregarina stammeri, Acarapis woodi i inne Acarapis Ataki drapieżców (Meloe variegatus, barciela. Trichodes apiarus, wachlarki-Stylops mellite, muchy – Physocphala vittata lub larw Senotainia tricuspis)

Krzepnięcie krwi i gojenie ran n n 1. 2. Ubytki krwi niewielkie Koagulacja krwi: Wypełnienie rany szybko krzepnąca hemolimfą „czop” – kilka sekund Odczyn hemocytarny – naciek granulocytów i plazmatocytów, adhezję między sobą i do brzegów rany oraz różnicowanie części hemocytów i tworzenie filopoidiów

Krzepnięcie krwi i gojenie ran n n Pojawia się skrzep w formie siatki z białek uwalnianych z hemocytów, materiału niebiałkowego i hemocytów Natychmiast po zranieniu zasklepianie Naciek komórkowy po 1 minucie (granulocyty i plazmatocyty) Czynniki zranienia (injury factors) Mobilizacja hemocytów osiadłych, szybka mitoza i wzrost ich liczby

Gojenie rany Wieloetepowo Uszkodzone i martwe tkanki, bakterie usuwane w fagocytozie Hemocyty nagromadzone w ranie różnicują się w formy podobne do fibroblastów Na osnowie skrzepu formuje się nowy nabłonek Plazmatocyty tworzą nabłonek rzekomy na który nasuwa się nabłonek właściwy. Stowarzyszony wzrost syntezy w ciele tłuszczowym białek hemolimfy (polipeptydy o działaniu przeciwbakteryjnym).