Universidade Federal de Pelotas Disciplina de Genmica II

Universidade Federal de Pelotas Disciplina de Genômica II Docente: Fabiana Seixas Aplicações da Eletroforese Capilar Ana Carolina Peiter Larissa Brussa Reis Micaela Domingues Rômulo Silva de Oliveira Stefani Natali Stoll Pelotas, 02 de maio de 2012.

O que é Eletroforese? Transporte em solução eletrolítica Influência de um campo elétrico. Diferenças de mobilidades

Histórico Eletroforese capilar -1981, por Jorgenson e Lukacs ~ à técnica tradicional. Tubo capilar, preenchido com um eletrólito.

O que é EC? Conduzida em TUBOS CAMPOS ELETRICOS 15 a ALTOS 100 µm /50 a BAIXO 100 TEMPO cm ALTA EFICIENCIA E RESOLUÇÃO

Fluxo Eletroosmótico Grupos silanóis (Si. OH) - (Si. O- + H+)soluções tampão. ânodo cátodo

Principais vantagens Fatores Geométricos A efic lta Ba iên c ixo tem ia po Pequena demanda de amostra Injeção e Detecção

Variações da EC Eletroforese capilar de zona (CZE) Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) Focalização isoelétrica capilar (CIEF) Eletroforese capilar em gel (CGE)

Variações da EC Eletroforese capilar de zona (CZE) Capilar e os reservatórios - cheios com um tampão. Corrente Elétrica + Poder Tamponante

Variações da EC Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) Variação da CZE Separa Moléculas neutras

Variações da EC Focalização isoelétrica capilar (CIEF) Separação -PI p. I não ocorre migração sob a ação de um campo elétrico Anfólito carreador

Variações da EC Eletroforese capilar em gel Separação pelo tamanho Ausência de Fluxo Eletroosmótico Migração através da matriz do gel

Variações da EC Eletroforese capilar em gel Oligonucleotideos PROTEÍNA

Variações da EC Eletroforese capilar em gel • Colóides liofílicas-poliacrilamida; • Colóides liofóbicos-agarose. Rede Polímérica

Vantagens gerais da EC • • RAPIDEZ VERSATILIDADE BAIXO CUSTO POR ANÁLISE ALTO PODER DE SEPARAÇÃO

Limitações gerais da EC Não é adequada para: • DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLATEIS • NÃO POLARES

Sequenciamento de DNA

Relembrando. . . Maxam & • Método Químico 1976 (EUA) Gilbert Sanger • Método enzimático&Coulson 1977 (Reino Unido)

Método de Sanger

Método de Sanger Molécula Nativa Desnaturação Cadeia simples = MOLDE!

Manual X Automático

Eletroforese Capilar (Sanger- Automatizado) 1) PCR tradicional 2) Purificação do produto 3) Nova PCR (placa) 4) Purificação da placa 5) Sequenciamento 6) Análise dos resultados

1) PCR COMPONENTES: • PROGRAMA: ü DNA molde • 94 0 C por 5 min ü d. NTP’s ü DNA Polimerase ü Primer • 94 0 C por 1 min • 55 0 C por 1 min • 72 0 C por 1 min ü Magnésio ü Tampão • 72 0 C por 5 min ü Água • 4 0 C 35 ciclos

2) Purificação do produto de PCR 2. 1) COM KIT: GFX PCR DNA (GE Healthcare) 3 formas • 1 de 50 ul • 2 de 25 ul Volume final 50 ul Kit GFX Enzimas 25 ul • Purificar • Eluir PEG 8000 • gel de agarose 5 ul

2) Purificação do produto de PCR • 2. 2) COM ENZIMAS Exonuclease I (EXO I) -GE Healthcare. E 70073 Z (2. 500 U) Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) - GE Healthcare E 70092 X 5000 U

Pós-purificação Condições para a reação de seqüenciamento:

3) Nova PCR purif + Primers (R/F) Nova PCR (DNA + Primers+ MIX)

3) Nova PCR 2 ul de pré -mix 1 ul do primer Termociclador Poços não utilizados: água 2 ul de DNA Spin Lacrar! Vortex

3) Nova PCR

Purificação da Placa- Protoloco Sequenciador

5) Sequenciamento MEGABACE • • • Sequencing e não Genotyping; RINSE TIPS limpeza dos capilares FLUSH AND DRY 1 X semana MATRIX FILL AND PRERUN: matriz INJECT SAMPLES AND RUN (lado da placa correto) • Placa com o LPA/ 180 minutos • Pós: Store Cappilars (25ºC)

4) Análise dos resultados (Cromatograma) Qualidade: BAIXA Picos Linha de base Distância entre picos

4) Análise dos resultados (Cromatograma) Qualidade: MÉDIA Picos Linha de base Distância entre picos

4) Análise dos resultados (Cromatograma) Qualidade: ALTA Picos Linha de base Distância entre picos

Genotipagem Processo pelo qual identificamos cada polimorfismo de interesse para um grande número de indivíduos

Tudo parte pelo o DNA a ser analisado. . . • Análise dos fragmentos de DNA amplificados por PCR • Sequenciamento de DNA Eletroforese Capilar

Em animais • Melhoramento clássico (seleção de indivíduos pelo seu fenótipo) • Escolhas de características como: carcaça, leite, sexagem, doenças. .

Em Microorganismos • Antes dos capilares, sequenciadores. . . (Tipagem por testes morfológicos e bioquímicos, sensibilidade a fagos, sensibilidade a bacteriocinas, perfis imunológicos e perfis de susceptibilidade a agentes antimicrobianos). • genes para proteínas da superfície celular • genes de resistência a antibióticos • genes codificando para o r. RNA 16 S.

Em Plantas • Melhoramento genético • Características comerciais: produção de amido; açúcar; • Resistência a pragas; • Resistência adversidades climais;

Em Humanos: • • • Paternidade; Doenças hereditárias; Criminalistica; Medicina individualizada; Oncologia;

Técnicas com Eletroforese Capilar

1. Análise de AFLP • • • Criação de mapas genéticos para novas espécies Determinação de parentesco entre as cultivares Estabelecimento de grupos de ligação em cruzamentos Diversidade genética e molecular Estudos de filogenia Variações nos padrões das banda permitem os indivíduos ser genotipados ou diferenciados com base sobre os alelos que carregam. Extração de DNA Enzimas de Restrição PCR Preparação das amostras Eletroforese Capilar Análise dos dados

2. Análise ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) (ISSR) PCR é uma maneira rápida e barata com base na variação nas regiões entre os microssatélites. Este método tem uma grande variedade de usos, incluindo: • Caracterização da relação genética entre populações, • Impressão digital genética, • Marcação de gene, • Detecção de variação clonal, Purificação do DNA Design de Primer PCR • Identificação de cultivares, • Análise filogenética, • Detecção de instabilidade genômica, • Avaliação de hibridização. Preparação das amostras Eletroforese Capilar Análise dos dados

3. Os microssatélites STR • Os locos de microssatélites conhecidos como STRs (short tandem repeats ou repetições curtas consecutivas) apresentam alelos ou fragmentos de DNA de 100 a 300 pb; • Estudos de mapeamento de ligação; • Estudos de associação e identificação de organismos.

3. 1. Instabilidade microssatélite • Descreve a fidelidade reduzida durante a replicação do DNA repetitivo frequentemente que ocorrem nas células tumorais.

4. SNP Genotyping • São variantes de DNA comuns presentes em todo o genoma humano • SNPS têm sido mostrados para ser responsável por : - diferenças nas características genéticas, - susceptibilidade a doenças e resposta a terapias de droga. Purificação do DNA Template Reação de Sequenciame nto Design de Primer Limpeza da Reação PCR Eletroforese Capilar Limpeza da Amostra Análise dos Dados

5. RFLP T-RFLP análise é uma técnica utilizada para estudar comunidades microbianas complexos baseados em variação no gene 16 S r. RNA. Tem sido usado para examinar as populações bacterianas em diversos ambientes naturais e compreender a estrutura da comunidade e dinâmica em resposta a alterações nos parâmetros ambientais ou fisiológico.

Aplicações Artigos Científicos, Teses e Dissertações

• Utilização acoplada à espectrometria de massa: Poder de resolução e eficiência da CE Universalidade e sensibilidade da MS tam n e s e r ap po e m u e q t s o Soluto ariações n smo e sv m a é n t e a u , ou peq o ã sma ç e a r m g i a de m com m er a s r g i m m e pod que , e d a d veloci ntificados. ide

Nos últimos 20 anos. . . • CE+MS notoriedade crescente como ferramenta analítica • Anualmente, a Electrophoresis, dedica uma edição especial inteira a trabalhos exclusivos com CE-MS.

Método s analít icos aplicado s a aná li clínicas ses Baixa disponibilidade de amostra Menos que 10 n. L de amostra por injeção Testes pediátricos, geriátricos e forenses

Cromatografia capilar eletrocinética micelar • Separar cafeína e outros derivados em amostras de saliva, soro e urina • Alíquotas aplicadas diretamente sem qualquer prétratamento • A resolução e a reprodutibilidade foram satisfatórias e somente 2 min foram consumidos para se efetuar a análise. Eletroforese capilar Cromatografia líquida de alta eficiência Sensibilidade, precisão e especificidade Método equivalente Tempo de análise 2 x menor Consumo de solvente é 100 vezes maior

Conclusão • Ferramenta valiosa na separação simultânea de metilxantinas e outros compostos com funções químicas diversas. • Sensibilidade, precisão e exatidão satisfatórias.

Análise de resíduos de pesticidas em alimentos • Análise de ácidos nucléicos, bem como seus adutos, por detectar níveis bem abaixo dos permitidos por lei. • Adutos de benzopireno foram avaliados, uma vez que são compostos policíclicos aromáticos presentes no meio ambiente.

Clínica • Metabólitos (hemoglobina glicada, cetoácidos, hormônios), • Forense: investigação de drogas (canabinóides, anfetaminas) em fluidos alternativos Ambiental Fármacos Alimentos Produtos naturais • Emissões veiculares (aldeídos e cetonas) e águas de abastecimento (pesticidas). • Pureza, qualidade de fármacos anti-retrovirais (AIDS) e anti-câncer (ftalocianinas metaladas). • Constituintes (carboidratos, ácidos graxos, ácidos carboxílicos, ), aditivos (corantes e vitaminas) e contaminantes (pesticidas). • Extratos vegetais (compostos fenólicos), óleos essenciais e hidrolisados de proteína de interesse fitoterápico.

Eletroforese Capilar como ferramenta analítica para a toxicologia forense

Fármacos e drogas de abuso de interesse forense Cloridrato de Metanfetamina designer drugs - Ectsasy Agente simpatomimétic o cloridrato de cocaína crack Heroína diacetilmorfina Morfina

Elaboração de sistemática analítica para determinação de drogas de abuso e seus produtos, empregando a técnica de Eletroforese Capilar. OBJETIVO • Soluções de trabalho em diferentes concentrações Soluções Padrão Equipamento • Capilar de Sílica fundida 75 um – 48, 5 cm 25 k. V • Na. OH 1 M por 5 min • Eletrólito de corrida -20 min Condições Preparo amostras • 87 amostras humor vítreo • Solventes orgânicos • Gráfico 3 D: tempo de retenção, espectro de luz e intensidade de luz absorvida Detector por arranjo de diodos

Resultados e Conclusões A Eletroforese Capilar com detecção de diodos pode ser utilizada para detecção e quantificação de drogas de abuso em humor vítreo, pois fornece limites de detecção, quantificação, precisão e exatidão adequados para essa finalidade.

Determinação e quantificação das vitaminas C e E associadas em produtos cosméticos

OBJETIVO • Extratos em pó • Placebo Amostras Validação das metodologias analíticas para a determinação e quantificação do derivado do ácido ascórbico, tetraisopalmitato de ascorbila e o princípio ativo acetato de tocoferila que estão associados nas formulações cosméticas. Análises • Espectrofotometria no UV • Cromatografia • Eletroforese capilar • Sílica – 50 cm/50 um • Na. OH 0, 1 M por 15 min • Água deionizada e eletrólito de corrida Eletroforese capilar

Resultados e Conclusões O desenvolvimento de metodologia analítica para a Eletroforese Capilar não obteve bons resultados através da técnica utilizando a microemulsão óleo-aquosa.

Desenvolvimento de metodologia para especiação de cromo em amostras por eletroforese capilar de zona

OBJETIVO • Açude da Marcela • Indústria de Curtume, Sergipe Amostras Propor um desenvolvimento de um sistema de Eletroforese Capilar de zona para a determinação e especiação de metais em amostras de águas Sistema Eletroforético • Caseiro: fonte de alta tensão, capilar, eletrodos de platina, detector de UV, software • Sílica, revestido pr grupos silanóis • Água destilada, HCl 1 M – 5 min • Na. OH 0, 1 M – 15 min • Solução eletrolítica Capilares

Resultados e Conclusões A eletroforese capilar de zona com detecção UV mostrou-se adequada para separação de complexos Cr(III)-EDTA com tempo de análise inferior a 5 minutos. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que Cr(III) foi totalmente complexado pela matéria orgânica dissolvida nas águas do curtume e do açude. Nenhum sinal referente aos picos do complexo foi observado nos eletroferogramas.

Referências • • • http: //www. fea. br/Arquivos/Biotecnologia/ http: //www. cenargen. embrapa. br/publica/trabalhos/ct 022. pdf http: //www. oocities. org/~esabio/eletrof. htm http: //blog. cca. ufscar. br/lamam/files/2010/07/sequenciamento. htm http: //www. scielo. br/pdf/qn/v 30 n 1/20. pdf http: //www. scielo. br/pdf/qn/v 31 n 8/37. pdf http: //www. scientiaplena. org. br/ojs/index. php/sp/article/view/761 http: //www. teses. usp. br/teses/disponiveis/59/59138/tde-29082006170445/pt-br. php http: //www. teses. usp. br/teses/disponiveis/9/9139/tde-30102008 -154631/ptbr. php http: //www 2. dbd. pucrio. br/pergamum/tesesabertas/0212144_06_cap_02. pdf http: //www. ufjf. br/ecologia/files/2009/11/estagio_docencia_Denise 1. pdf http: //www. scielo. br/pdf/qn/v 20 n 5/4891. pdf

Obrigado pela atenção!