2008 ORGANIZACE A KONTROLA EUKARYOTICKHO GENOMU Organizace genomu

2008 ORGANIZACE A KONTROLA EUKARYOTICKÉHO GENOMU

Organizace genomu I prokaryotický genom není jen nahá DNA uložená v cytoplasmě, ale je spojena s řadou proteinů a je skládána do smyček Eukaryotický chromatin je však mnohem komplexnější DNA jednoho „průměrného“ chromosomu člověka měří 6 cm (!) DNA všech 46 lidských chromosomů měří 2 metry (!!)

Nukleosomy: „korálky na šňůře“ První úroveň sbalení DNA realizují histony. Histonů je v chromosomu přibližně stejné množství jako DNA! Histony jsou tvořeny převážně z + nabitých aminokyselin, jako je Arg a Lys, které se dobře vážou k negativně nabitým fosfátům DNA Existuje 5 typů histonů: H 1, H 2 A, H 2 B, H 3 a H 4 Geny pro histony jsou prakticky totožné u všech eukaryot a dokonce i prokaryota mají podobné proteiny. Jedná se tedy jistě o velmi důležité a velmi konservativní geny

Eukaryotický genom

DNA eukaryotického chromosomu z vyvíjejícího se vajíčka mloka

Nukleosomy Nukleosom je tvořen oktamerem histonů: H 2 A, H 2 B, H 3 a H 4 jsou každý obsaženy dvakrát Histon H 1 funguje jako svorka mezi jednotlivými nekleosomy Histony opouští DNA pouze při replikaci… …naopak při transkripci zůstávají připevněny k DNA – zdá se, že změnou tvaru a pozice nějak umožní RNA polymeráze čtení minus řetězce DNA

„Korálky na šňůře“ „Beads on a string“ N konec každého histonu směřuje ven z oktameru

DNA so obtáčí kolem histonu prostorový model

Histony tradičně se myslelo, že přepisování DNA je řízeno transkripčními faktory sedající na 5´konec DNA to je ale jen část příběhu posttranslační úpravy histonů zřejmě odpovídají za regulaci genové exprese: na upravené histony nasedají proteiny, které určí, které části DNA budou přepsány RNA polymerázou (!) velmi častá je acetylace N konců (to jsou ty, které „trčí“ ven) – acetylací se zmenšuje kladný náboj a histony jsou tak náchylnější k transkripci, neboť DNA se již na ně tak pevně neváže schopnost acetylace je zřejmě klíčová pro život pokud pokusně mají kvasinky zaměněný lysin na arginin (který si zachovává kladný náboj a nemůže být acetylován), kvasinky umírají

Histony acetylace je dynamický proces transkripční koaktivátory obsahují acetyltransferázy které histonové lysiny acetylují, korepresory mohou obsahovat deacetylázy, které acetyly odstraňují

Důležitost histonu H 1 A: obvyklé sbalení DNA do 30 nm vlákna E: bez H 1 F: s H 1

Vyšší úroveň organizace chromosomů 1. Nukleosomy tvoří vlákno 10 nm Oproti nahé DNA nukleosomy 7 x zkracují délku DNA jádro buňky člověka obsahuje 3, 3 x 107 nukleosomů 2. S pomocí H 1 vzniká 30 nm vlákno Oproti nahé DNA 30 nm vlákno 40 x zkracuje délku DNA 3. Toto 30 nm vlákno tvoří smyčky, které jsou připevněny k nehistonovým bílkovinám, které tvoří tzv. proteinové lešení 300 nm silné 4. Dalšími ohyby a skládáním těchto smyček vzniká chromosom – jedna chromatida je cca 700 nm silná

30 nm vlákno

300 nm vlákno

Chromosom

Chromosomy Ovšem i interfásový chromosom si udržuje jistou úroveň sbalení Předpokládá se, že v interfázi zůstává zachováno 30 nm vlákno, které nehistonové proteiny váží k nukleární lamině a snad i k nukleární matrix Toto připevnění tak dává každému z interfázových chromosomů své přesné místo v jádře a zabraňuje tak zamotání jednotlivých chromosomů

Heterochromatin a euchromatin I u interfázových chromosomů se některé jejich části nachází ve velmi kondensovaném stavu, tak že jsou barvitelné a pozorovatelné mikroskopem – jedná se o tzv. heterochromatin. Heterochromatinová DNA není přepisována Euchromatin = „pravý chromatin“ je přepisován a nachází se v mnohem více rozvolněném stavu

Odlišní exprese genů u odlišných buněk všechny buňky našeho těla vznikly mitózou, první buňkou byla zygota (téměř) všechny buňky našeho těla obsahují stejný genom jak je tedy možné, že se naše tělo skládá z cca 200 typů buněk? (svalové, nervové…? ) typická lidská buňka přepisuje v daném čase jen asi 20 % svých genů velmi diferencované buňky, jako jsou svalové buňky, přepisují dokonce ještě menší procento genů

Odlišní exprese genů u odlišných buněk jednotlivé buňky se tedy od sebe liší ani ne tak tím, že by obsahovaly odlišné geny, nýbrž tím, že odlišné geny jsou exprimovány otázkou tedy jest, jak může RNA polymeráza najít v nezměrném moři písmen začátek správného genu, který má v této buňce v tomto čase přepsat

Geny „housekeeping genes“ – geny, které se přepisují ve všech buňkách patří sem např. geny pro histony, geny pro ribosomální proteiny atd.

v každé z těchto oblastí může proběhnout regulace genové exprese

Kontrola genové exprese

Kontrola genové exprese Organizace chromatinu v jádře DNA metylace. Zejména cytosin. Asi 5% cytosinů lidské DNA je metylováno. Velmi je metylována DNA neaktivního X chromosomu (Barrova tělíska). Metylované geny se předávají v jednotlivých mitózách dál, protože metylační enzymy jsou schopny je rozeznat a metylují dceřinný řetězec při replikaci – tapisérie metylovaných genů se tak při růstu tkáně předává dál. Metylace rovněž hraje roli při genovém imprintingu.

Kontrola iniciace transkripce začíná vytvořením transkripčně iniciačního komplexu = transkripční faktory + promotor + RNA polymeráza kontrolní elementy = segmenty nekódující DNA, na které se navazují transkripční faktory (striktně vzato je i promotor kontrolním elementem)

Kontrola iniciace transkripce

Role transkripčních faktorů RNA polymeráza nemůže sama zahájit transkripci jen jeden transkripční faktor rozeznává TATA box, jiné rozeznávají proteiny - buď jeden druhý nebo RNA polymerázu takto ale probíhá transkripce jen pomalu a nedokonale klíčem k rychlé transkripci jsou kontrolní elementy

Posilovače transkripce - enhancery mohou být až tisíce pb vzdáleny od promotory proti proudu nebo i po proudu mohou se dokonce nacházet i v intronech do kontaktu s promotorem se dostávají ohybem DNA aktivátor = transkripční faktor, který se váže na enhancer a popoří transkripci daného genu

Posilovače transkripce

Vazba transkripčních faktorů k DNA

Posttranskripční mechanismy kontrolují genovou expresi mezi syntézou primárního transkriptu a činností aktivního proteinu v buňce se může nacházet řada kontrolních kroků může např. dojít k alternativnímu sestřihu

Regulace degradace m. RNA prokaryotické m. RNA mají typicky velmi krátkou životnost a enzymy je degradují po několika minutách - tím je také způsobeno, že bakterie pružně a rychle reagují na měnící se životní podmínky u eukaryot m. RNA přetrvává typicky hodiny, ale i dny a často i týdny pověstná dlouhým životem je např m. RNA pro oba globinové řetězce

Regulace degradace m. RNA začíná enzymatickým zkracováním poly(A) konce to rozběhne aktivitu enzymů, které odstraní čepičku po odstranění čepičky nukleázy rychle odbourají m. RNA od 5´ konce

Kontrola translace většinou je regulována iniciace translace (připojení m. RNA na malou podjednotku, připojení t. RNAMet a připojení velké podjednotky) např. v oocytu je velké množství předem připravených m. RNA, které se po fertilizaci překládají ve správném čase a správném pořadí. některé faktory zastavují translaci všech m. RNA. Pokud např. ve vznikajícím erytrocytu je málo hemů, rewgulační proteiny zastavují celou translaci - většina m. RNA je ovšem m. RNA pro globiny

Kontrola translace v oocytech mnoha organismů je připraveno množství m. RNA - teprve po fertilizaci dojde k rychlé aktivaci translačních iniciačních faktorů. Výsledkem je explozívíní přepis mnoha m. RNA některé řasy a rostliny za noci zastavují translaci, kterou aktivuje až světlo

Posttranslační úpravy proteinů a jejich degradace z insulinu musí být vyštěpena část řetězce, na jiné proteiny musí být navěšena sacharidová skupina, jiné proteiny mohou být aktivovány/deaktivovány reversibilním připojením fosfátové skupiny, jiné musí být dopraveny na správné místo v buňce - zde všude může probíhat regulace

Posttranslační úpravy proteinů a jejich degradace např. cystická fibrosa je způsobena tím, že (díky mutaci v genu) protein, který má být normálně membránový a obsahuje v sobě kanál pro transport chloridových iontů, se nedostane na své místo do plasmatické membrány a v cytoplasmě je rychle degradován např. cykliny musí mít krátkou životnost a musí být rychle degradovány, aby pracovaly správně

Posttranslační úpravy proteinů a jejich degradace začíná připevněním malé molekuly zvané ubiquitin na protein obrovský proteinový komplex, zvaný proteasom, pak rozezná ubquitinovou „visačku“ a degraduje označený protein cykliny, které vzdorují degradaci mohou způsobit rakovinu

Proteasom degraduje proteiny

Organizace genomu na úrovni DNA U prokaryot většina DNA kóduje proteiny a jednotlivé geny jsou odděleny jen krátkými úseky nekódující DNA U eukaryot naopak jen asi 1, 5% (!) DNA kóduje proteiny další malé procento kóduje nějaký jiný typ RNA než m. RNA Zbytek - nekódující DNA u eukaryot je tvořena částečně introny, ale především tzv. repetitivní DNA

Tandemové repetice jsou krátké sekvence nukleotidů, opakované mnohokrát za sebou, např. GTTACGTTACGTTACGTTA C Sekvence GTTAC se může až několik set tisíckrát opakovat – evoluční význam tohoto jevu (je-li jaký) je záhadou. Možná se jedná jen o „odpadní“ DNA Počet nukleotidů v sekvenci je obvykle 2 - 10

Tandemové repetice Díky tomu, že tandemové repetice se opakují tolikrát za sebou, má tata část chromosomu poněkud jiné složení CG a AT než ostatní části chromosomu Pokud je chromosom rozbit na malé kousky, tandemová DNA při centrifugaci vytvoří v centrifugační zkumavce pruh v poněkud jiné výšce, než zbytek chromosomu Proto se této DNA začalo říkat „satelitní DNA“ Nyní je tento termín užíván pro všechnu tandemovou DNA

Satelitní DNA se dělí na tři typy: Satelitní DNA (100 000 – 10 milionů opakování) Minisatelitní DNA (100 – 100 000 opakování) Mikrosatelitní DNA (10 – 100 opakování)

Satelitní DNA Některé genetické choroby jsou způsobeny nesprávným počtem repetic Fragilní X chromosom = mentální retardace. Počet repetic CGG na nepřekládaném začátku genu je u zdravých osob přibližně 30. U nemocných se tento triplet vyskytuje ve stovkách nebo i tisících opakováních. Počet opakování se zvyšuje v průběhu generací Huntingtonova choroba: zde je triplet CAG překládán (do glutaminu). U zdravých osob je počet repeticí do 35, u nemocných 40 – několik set

Satelitní DNA Mnoho satelitní DNA se nachází v telomerách a v centromeře

Vmezeřená repetitivní DNA Intrespersed Repetitive DNA Tvoří 25% - 40% DNA savců Repetice zde nenásledují těsně za sebou, ale jsou rozptýleny na různých místech genomu Repetice je obvykle dlouhá stovky až tisíce pb a její jednotlivé kopie se obvykle mírně odlišují Alu elementy: tvoří 5% genomu člověka. Jedná se o 300 pb dlouhou repetici. Výjimka: Ale elementy se překládají do proteinu. Význam tohoto proteinu v buňce, je-li jaký, není znám

Genové rodiny U prokaryot i u eukaryot se většina genů vyskytuje jako unikátní sekvence DNA, v jediném provedení v haploidním genomu Některé geny se však vyskytují ve více než jednom provedení. Soubor stejných nebo velmi podobných genů se nazývá multigenová rodina Genovou rodinu můžeme chápat jako tandemovou repetici s velmi dlouhou (=jeden gen) repetiční jednotkou

Genové rodiny Některé genové rodiny obsahují identické geny tandemově uspořádané - např. geny pro histony Většinou však genové rodiny neobsahují geny pro bílkoviny, ale pro RNA Za příklad mohou posloužit rodiny pro r. RNA – zde jedna jednotka obshuje geny pro tři r. RNA (18 S, 5, 8 S a 28 S r. RNA) Tato jednotka se opakuje ve stovkách – tisících kopiích. Primární transkript je štěpen na tři r. RNA. Takto má buňka materiál pro miliony ribosomů

Genové rodiny

Multigenové rodiny Klasickým příkladem jsou geny pro globiny – proteiny, ze kterých se sestavuje hemoglobin Rodina na chromosomu 16 obsahuje geny kódující různé verze α-globinu Rodina na chromosomu 11 obsahuje geny kódující různé verze β-globinu Různé verze globinových genů jsou přepisovány v různých fázích embryonálního a fetálního vývoje

Globinová rodina Nejpravděpodobnější vznik je opakovaným zdvojením původně jednoho genu Rozdíly mezi jednotlivými geny pravděpodobně vznikly nahromaděním mutací v průběhu evoluce Pseudogeny: útvar velmi podobný genu, ale buď se nepřekládá, nebo kóduje nefunkční produkt. Globinová rodina obsahuje několik pseudogenů

Transpozony a retrotranspozony Transpozon = sekvence DNA, která se může přesunout z jednoho umístění na genomu do jiného Pokud transpozon „skočí“ doprostřed jného genu, může jej vyřadit z činnnosti Trasnpozony tvoří 50% genomu kukuřice a cca 10% genomu člověka Většina transpozonů jsou retrotranspozony

Např. Alu elementy jsou retrotranspozony. U člověka aktivní transpozony nejsou známy.

Kontrola genové exprese V průběhu buněčné diferenciace jsou zapínány a vypínány různé geny – výsledkem je, že se jedna buňka liší od druhé, např. neuron od svalové buňky Typická buňka přepisuje v daném čase jen asi 3 -5% svých genů Enzymy přepisující DNA (RNA polymeráza) musí najít správné geny ve správném čase

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE RAKOVINY

Protoonkogeny rakovina vzniká poškozením genů kontrolující buněčný růst a dělení, a to buď fyzikálními nebo chemickými agens (mutageny, X-zářením atd. ) protoonkogen = gen, který stimuluje normální buněčný růst a dělení onkogen = gen, který způsobuje rakovinu onco = řec. tumor, nádor

Změna protoonkogenu na onkogen přesun genu na jiné místo v genomu amplifikace (zmnožení) protoonkogenu bodová mutace v protoonkogenu

Změna protoonkogenu na onkogen

Změna protoonkogenu na onkogen Maligní buňky mají často chromosomové translokace, díky kterým se dostávají protoonkogeny do blízkosti silných promotorů a jsou přepisovány častěji. Jindy je to promotor, který se přesune do blízkosti protoonkogenu mutace může způsobit, že protein je více aktivní nebo více odolný vůči degradaci

Tumor supresorové geny translační produkty těchto genů normálně pomáhají zastavit nekontrolovatelný růst translační produkty tumor supresorových genů mají normálně v buňce různé úkoly: opravují poškozenou DNA kontrolují adhezi buněk k sobě či k extracelulární matrix jiné přímo inhibují buněčný cyklus

ras protoonkogen a p 53 tumor supresorový gen 30% rakovin člověka má poškozený ras gen 50% rakovin člověka má poškozený p 53 gen Ras protein i p 53 protein jsou součástmi drah, kterými je z cytoplasmy ovlivněna aktivita jádra

Ras protein a p 53 protein

Ras protein jedná se o tzv G protein (aktivovaný GTP), který je součástí dráhy, předávající signál růstového faktory přes celou cytoplasmu až do jádra normálně je dráha spuštěna růstovým faktorem mutovaný ras protein spouští dráhu i v nepřítomnosti růstového faktoru

p 53 protein „guardian angel of the genome“ je tumor supresorový protein o hmotnosti 53 000 Daltonů p 53 je trasnkripční faktor, který stimuluje syntézu proteinů inhibujících růst buňky: aktivuje gen p 21, jehož proteinový produkt se váže k cyklin-dependentním kinázám, čímž je získán čas pro opravu DNA aktivuje geny, jejichž proteiny opravují DNA pokud je DNA neopravitelná, aktivuje „sebevražedné“ geny, které rozběhnou apoptózu

Rakovinu způsobí až mnohonásobná mutace …což vysvětluje, že rakovin přibývá s věkem příklad: kolorektální karcinom - 135 000 nových případů v USA každý rok nejprve vzniká polyp, tvořený „normálními“ buňkami, které se jen rychleji dělí tumor roste a může se stát maligním - tak, že se v jeho buňkách hromadí mutace tvořící onkogeny a knock-outované tumor supresorové geny

Rakovinu způsobí až mnohonásobná mutace tumor supresorové alely jsou většinou recesívní - musí tedy zmutovat obě naopak onkogeny jsou většinou dominantní - stačí, aby zmutovala jedna nakonec je aktivován gen pro telomerázu

Rakovina tlustého střeva

Další příčiny vzniku rakoviny viry: asi 15% případů retroviry způsobují leukémie viry hepatitidy způsobují rakovinu jater způsobují rakovinu děložního hrdla buď přinesou s sebou onkogen, nebo se vloží do tumor supresorového genu, nebo aktivují protoonkogen

Dědičnost rakoviny rakovina není dědičná obvyklou mendelovskou dědičností dědičná může být např. jedna mutace tumor supresorového genu - potomstvo je tedy o jeden krok blíže k vypuknutí rakoviny 15% kolorektální rakoviny obsahuje již zděděné mutace, řada z nich zasahuje geny produkující proteiny opravující DNA

Rakovina prsu v USA 180 000 žen (!) každý rok u 5%-10% silná dědičná disposice zejména geny BRCA 1 a BRCA 2 (BReast CAncer) - jejich mutace podporuje vznik rakoviny prsu i vaječníků. Oba jsou možná tumor supresorové a jsou recesívní. Snad se i podílejí na opravě DNA

Rakovina prsu