DNA struttura e replicazione Cromosomi 1 Nei primi

DNA struttura e replicazione Cromosomi 1

Nei primi decenni del ‘ 900 si raccolgono evidenze che i cromosomi sono costituiti da DNA e proteine. - Qual è la molecola responsabile dell’informazione biologica? - Qual è la sua struttura? Esperimenti di importanza fondamentale (Griffith, Avery et al. , Hershey et al. ) vengono effettuati negli anni ’ 30 -50 su organismi semplici, quali batteri e batteriofagi e dimostrano che il materiale genetico è il DNA 2

1950 E. Chargaff scopre che nel DNA di specie diverse c’è proporzionalità nella composizione in basi azotate: organismo A% T% G% C% Pneumococco 29. 8 31. 6 20. 5 18. 0 lievito 31. 3 32. 9 18. 7 17. 1 Riccio di mare 32. 8 32. 1 17. 7 18. 4 E. coli 26 24. 9 24. 8 25. 2 uomo 30. 9 29. 4 19. 9 19. 8 ratto 28. 6 28. 4 21. 5 A=T, C=G La quantità totale delle purine (A+G) è uguale a quella delle pirimidine (T+C) 3

Cristallografia a raggi X (1952 R. Franklin) R. Franklin M. Wilkins L’ immagine di diffrazione ottenuta è compatibile con una struttura elicoidale 4

Nel 1953 James Watson e Francis Crick, basandosi sulle osservazioni di cristallografia ai raggi X di Rosalind Franklin e sull’osservazione di Erwin Chargaff, propongono il modello a doppia elica per la molecola di DNA 5

Il DNA è un polimero di nucleotidi Nucleotide: molecola formata da uno zucchero pentoso (desossiribosio), un gruppo fosfato e una base azotata (A, C, G, T) 5’ A T G C 1’ 4’ 3’ 2’ purine 5’ 3’ pirimidine 6

Modello a doppia elica del DNA ¯Il DNA ha una struttura ad elica (in accordo coi dati di cristallografia) a doppio filamento ¯Gli scheletri zucchero-fosfato sono posizionati esternamente, mentre le basi sono dirette verso l’interno e si appaiano (tramite legami 2 nm idrogeno) alle basi “complementari” del filamento opposto in accordo con quanto osservato da Chargaff (in tutti i DNA % A = % T; % C = % G). L’appaiamento è sempre purina-pirimidina e questo mantiene il diametro dell’elica uniforme ¯I due filamenti sono antiparalleli 7

Il diametro si mantiene costante perché le purine si appaiano alle pirimidine 2 nm G ≡ C: 3 legami H A = T: 2 legami H 8

Il modello prefigurava genialmente una modalità di replicazione semiconservativa che verrà poi sperimentalmente dimostrata da Meselson e Stahl nel 1958 Ogni filamento dell’elica funziona da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, sfruttando la complementarietà delle basi 9

Modelli ipotetici di replicazione del DNA Filamento parentale Filamento nuovo Alla fine del processo di sintesi potremmo ottenere: ¯due molecole di DNA ciascuna costituita a un filamento di nuova sintesi e da un filamento originario (semiconservativa) ¯una molecola di DNA costituita da due filamenti parentali e l’altra da due filamenti di nuova sintesi (conservativa) ¯due molecole di DNA costituite entrambe da un’alternanza di filamenti nuovi e parentali 10 (dispersiva)

La replicazione del DNA è semiconservativa: ciascuno dei due filamenti parentali serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove doppie eliche sono costituite da ognuna da un filamento vecchio e da un filamento nuovo 11

Tutte le DNA polimerasi in tutti gli organismi sono capaci di sintetizzare DNA soltanto in direzione 5’-3’ 5’ 3’ Direzione di sintesi DNA polimerasi DNA dipendente 12

nucleotide (nucleoside trifosfato): elemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleici 13

La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato (nucleotide) all’estremità 3’OH 5’ 5’ 3’ 3’ 14

La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato all’estremità 3’OH 15

Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in direzione opposta 5’ 5’ Direzione di sintesi 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 3’ 16

Replicazione del DNA 1 ¯ ¯ In corrispondenza delle origini di replicazione l’elicasi svolge i filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi e generando due filamenti singoli Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e lo stabilizzano Denaturazione del DNA helicase Origin of replication 17

Replicazione del DNA 2 ¯ ¯ La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex novo la sintesi, ma solo di allungare un 3’ preesistente) La DNA polimerasi III estende l’innesco a RNA sintetizzando DNA innesco 3’ helicase 18

La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa direzione di avanzamento della elicasi e quindi in maniera continua … Ma cosa succede sul filamento complementare? Leading strand helicase 19

Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera discontinua (la DNApol III va in direzione opposta rispetto all’elicasi), attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di Okazaki) 5’ 3’ 5’ helicase primase 20

Replicazione del DNA 3 Rimozione del primer a RNA e “gap filling” da parte della DNA pol I che attacca nucleotidi al 3’ libero del frammento di Okazaki precedente mentre degrada il primer a RNA 5’ helicase 21

Azione della DNA pol I Primer RNA 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ DNA pol I 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 3’ DNA pol I 3’ 22

Replicazione del DNA 4 Saldatura dei frammenti (ligasi) 5’ helicase ligase 23

Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in direzione opposta. I frammenti vengono poi saldati 25

La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei superavvolgimenti Topoisomerasi I rompono transitoriamente una sola delle catene del DNA, la ruotano attorno a quella integra e infine riuniscono le estremità interrotte Le Topoisomerasi hanno il compito di rilassare (eliminare) le tensioni che si creano nella doppia elica del DNA in seguito ai processi cellulari che implichino un cambiamento di topologia del DNA (trascrizione, 28 replicazione del DNA)

Replicazione del DNA circolare ORI è sequenza ricca in A-T Nei procarioti l’origine di replicazione è singola Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI 29

Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multiple Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI multiple 30

Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno origini di replicazioni multiple Le DNA polimerasi eucariotiche hanno una velocità di incorporazione di 75 nucleotidi al secondo La lunghezza media di un cromosoma umano è 1. 4 x 108 bp (3. 2 x 109 bp genoma aploide/ 23 cromosomi) Se ci fosse una singola ORI, per duplicare un singolo cromosoma medio occorrerebbero più di 10 giorni In realtà la fase S dura circa 8 ore 31

Il cromosoma batterico ha un’unica ORI Il genoma di E. coli è lungo 4. 6 x 10 6 bp La velocità dellla Pol III arriva fino a 1000 nt/ sec Per replicare il cromosoma occorrono: 4. 6 x 10 6 bp = 70 min c. a 1000 nt/sec su ogni lato della forca replicativa quindi 35 min c. a 32

Caratteristiche delle DNA polimerasi ¯ Hanno attività polimerasica SOLO in direzione 5’-3’ ¯ Necessità di innesco a RNA (primer) ¯ Attività esonucleasica 3’-5’ correzione di bozze 33

Alla DNA polimerasi è associata un’attività esonucleasica che consente la “correzione di bozze”= rimozione di nucleotidi errati Con questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessi dalla DNA pol mentre la replicazione è in corso tasso di errore durante la sintesi 1 su 10. 000 nt; dopo correzione 1 su dieci miliardi nt È sufficientemente basso? 34

Nel genoma umano (aploide) ci sono c. a. 3 x 109 nt di questi solo 6 x 107 nt (il 2%) sono sequenze codificanti (esoniche) Se non ci fosse correzione di bozze (tasso di errore durante la sintesi 1 x 10 -4 nt): 6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA Dopo correzione di bozze ( 1 x 10 -10 nt ): 0. 006 mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA (1 mutazione ogni 166 replicazioni) Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché intervengono dei processi di riparazione del DNA post-replicativi 35

RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair) provvede ad effettuare una scansione del DNA dopo la replicazione alla ricerca di appaiamenti errati Il sistema di riparazione è in grado di riconoscere e riparare il filamento di nuova sintesi 36

tasso di errore durante la sintesi 1 x 10 -4 nt dopo correzione 1 x 10 -10 nt …è sufficientemente basso? Difetti nel “mismatch repair” Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti nel mismatch repair sono associate al cancro. La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si accumulano in tutto il genoma e che, quando colpiscono geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non poliposico ereditario HNPCC, autosomica dominante) 37

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I processi di riparazione del DNA post replicativi sono ESSENZIALI 39

Un errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazione successivi 40

Cromosomi 41

Cromatina ¯ ¯ All’interno del nucleo della cellula eucariotica si trova la cromatina (DNA genomico + proteine) La cromatina appare organizzata in entità separate (cromosomi) quando la cellula è in mitosi interfase tarda profase inizio anafase 42

Cromosomi metafasici altamente condensati braccio p centromero braccio q Ciascun cromosoma, dopo la fase S, è costituito da due cromatidi fratelli, tenuti insieme dal centromero 43

Telomeri Sequenze ripetute all’estremità dei cromosomi ¯ costituiti da alcune migliaia di ripetizioni di sequenze brevi ¯ nell’uomo: (TTAGGG)n ¯ Proteggono il cromosoma dalla degradazione ad opera di nucleasi (sono ripiegati su se stessi) ed impediscono che le estremità dei cromosomi si saldino tra di loro ¯ 44

Telomeri ¯ ¯ ¯ Nelle cellule germinali e nelle cellule staminali la lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni divisione cellulare grazie all’attività della telomerasi Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni replicazione del DNA il telomero subisce un accorciamento La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca arresto della crescita cellulare e apoptosi 45

Replicazione dell’estremità del cromosoma DNA stampo primer fine cromosoma DNA in sintesi 46

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Centromero ¯ È la regione del cromosoma in cui i cromatidi fratelli sono uniti ¯ Sequenza ripetute ¯ In corrispondenza del centromero ci sono due cinetocori (uno per cromatidio) che servono ad agganciare il cromosoma alle fibre del fuso 48

Lunghezza del DNA genomico ¯ ¯ ¯ Distanza tra due coppie di basi 0. 34 nm 3 x 109 bp (numero di basi di un genoma aploide umano) x 0. 34 nm (distanza tra due coppie di basi) = 1 metro (lunghezza di un genoma umano aploide) Deve essere compattato in un nucleo di pochi m!!! 49

Nucleosoma ¯ L’unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma: tratto di DNA (146 bp) avvolto con c. a. due giri attorno a un core formato da un ottamero istonico ¯ Istoni: proteine cariche positivamente (arg, lys) che interagiscono coi gruppi fosfato del DNA 11 nm 2 nm 50

H 2 A H 2 B H 4 H 3 11 nm (1. 65 giri, 146 pb) H 3 H 2 A H 4 Ottamero istoni: 2 molecole di H 2 A, H 2 B, H 3 e H 4 51

Istone H 1 e fibra da 30 nm ¯ L’istone H 1 (di giunzione) ha la funzione di compattare ulteriormente i nucleosomi ¯ Promuove la formazione della fibra solenoide da 30 nm 11 nm H 1 52

Il cromosoma metafasico presenta un alto grado di compattazione della cromatina 53

Eucromatina-eterocromatina Eterocromatina è più compatta e trascrizionalmente inattiva Eucromatina interfasica trascrizionalmente attiva; si trova allo stato di cromatina distesa ed è accessibile agli enzimi della trascrizione 54

Eucromatina-eterocromatina a eucromatina: frazione nucleare trascrizionalmente attiva e a bassa densità b eterocromatina: frazione trascrizionalmente inattiva ed elettrondensa a b sezione al microscopio elettronico 55

Cromosoma X e compensazione del dosaggio genico Maschio livello di espressione femmina Nella femmina un cromosoma X viene inattivato per equiparare il dosaggio genico a quello del maschio 56

Nelle femmine di mammifero uno dei due cromosomi X è inattivato ed è sempre condensato. Il cromosoma X inattivo è visibile nel nucleo interfasico di cellule ♀ come una masserella di cromatina condensata, addossata alla membrana nucleare Viene chiamata cromatina sessuale o corpo di Barr Nuclei di cellule della mucosa orale di ♀ (sinistra) e ♂ (destra) 57

Cariotipo Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e dalla morfologia (posizione del centromero e dimensioni) dei suoi cromosomi metafasici 58

Il cariotipo umano Nel 1955 Tjio e Levan (analizzando centinaia di metafasi in 5 tessuti provenienti da 7 individui) dimostrano che il numero esatto di 59 cromosomi umani è 46

Cromosomi umani ¯ #1→ 22 sono uguali nel maschio e femmina (autosomi) nella ¯ La 23 esima coppia è quella dei cromosomi sessuali: XX nella femmina (sesso omogametico) XY nel maschio (sesso eterogametico) 60

Denaturazione e rinaturazione in vitro del DNA 61

Rinaturazione in presenza di una sonda rinaturazione sonda denaturazione La sonda è una sequenza di DNA complementare a una determinata sequenza di interesse, che viene marcata con radioattivo o con fluorocromi 62

Ibridazione del cromosoma con sonde fluorescenti Cromosomi metafasici su vetrino; Denaturazione del DNA, rinaturazione in presenza di un eccesso di sonda fluorescente specifica per una determinata regione 63 del cromosoma

telomero sonda …AATCCCAATCC TTAGGG* 64

Fluorescent In Situ Hybridization 65

Origine evolutiva del cromosoma 2 umano 66

Origine evolutiva del cromosoma 2 umano: fusione di cr 12 e cr 13 di pan troglodites Sequenze telomeriche 67