PCR proteina C reattiva E la classica proteina

PCR (proteina C reattiva) • E’ la classica proteina della fase acuta, è costituita da 5 catene identiche = pentaxina, proteine leganti il calcio, con proprietà di difesa; • Banda • un valore <5 mg/L è considerato normale • è capace di legarsi ad un elevato numero di sostanze, sia esogene che endogene e quindi di facilitare la loro rimozione dal circolo (opsonizzazione). • La sua sintesi da parte degli epatociti è sotto il controllo delle citochine proinfiammatorie (IL- 6) indotta durante l’infiammazione acuta e cronica (le endotossine batteriche sono i più potenti stimoli alla produzione di PCR), ma anche in alcune neoplasie (linfoma non-Hodgkin’s) e nelle malattie autoimmunitarie e da immunocomplessi. • Al termine dello stimolo da parte di IL- 6 la produzione della PCR si normalizza entro 2 -4 ore; l’emivita ematica della proteina è di circa 24 ore.

Le variazioni della PCR (proteina C reattiva) : Un aumento di PCR è sempre indice di patologia o di infiammazione acuta o cronica, malattia autoimmunitaria, necrosi tissutale e cancro; mentre valori normali non escludono la presenza di piccoli focolai infiammatori, in cui la risposta della fase acuta è minima. Valori di Riferimento • adulti e bambini = 0, 06 - 10 mgL • neonati < 0, 06 mgL • bambini fino ad 1 mese < 1, 6 mgL Il grado di aumento della PCR riflette la massa o l’attività del tessuto infiammato: • PCR tra 10 e 50 mgL = leggera infiammazione, infezioni virali • PCR tra 50 e 100 mgL = malattia più severa, infezioni da Gram+ • PCR > 100 mgL = infezione batterica da Gram-

La valutazione della PCR è importante: • Per diagnosticare e/o monitorare un’infezione, quando le indagini microbiologiche sarebbero troppo lente (complicazioni infettive post-operatorie, terapia intensiva, neonatologia, infezioni per neutropenia da chemioterapici o post-trapianto, monitorare la risposta alla terapia antibiotica) • Per lo screening di un processo infiammatorio (infezioni, IMA, trombosi venose profonde, malattie reumatiche, neoplasie) • Per il monitoraggio delle malattie reumatiche • Per la diagnosi differenziale di alcune patologie gastro-intestinali (colon irritabile da patologie organiche; colite ulcerosa da morbo di Crohn) • Importante come fattore prognostico e di stratificazione del rischio cardiovascolare (dato il ruolo dell’infiammazione cronica nello sviluppo delle patologie cardiovascolari). • La PCR quindi misurata con metodi ad elevata sensibilità analitica è il marcatore che meglio risponde ai requisiti di praticabilità, adattabilità alla misura in automazione; la PCR può quindi essere considerata un marcatore di scelta in questo ambito.

IMMUNOGLOBULINE VALORI NORMALI 0, 9 – 1, 4 g/d. L Le immunoglobuline G, M, A, D, E possono essere visualizzate tramite elettroforesi nella banda delle gamma-globuline. • Esse costituiscono gli anticorpi umorali in grado di facilitare la distruzione degli antigeni estranei all’organismo da parte del sistema immunitario • Sono sintetizzate e secrete dalle plasmacellule (derivanti dai linfociti B) • Poichè la frazione Ig. G, in condizioni normali, è prevalente sulle altre, la banda delle -globuline è rappresentata soprattutto dalle Ig. G.

IMMUNOGLOBULINE Glicoproteine tetrameriche costituite da due catene pesanti di ~440 amminoacidi e due catene leggere di ~220 amminoacidi, uguali a due. Le catene pesanti H (γ, ɑ, μ) e leggere L (ĸ, λ) sono tenute assieme da ponti disolfuro intercatenari. Ciascuna catena è divisa in una regione costante e una variabile (amminoterminale), e su quest'ultima sono localizzate le sequenze amminoacidiche concorrono alla formazione del sito di legame.

- Ig. G : circa il 70 -80% delle immunoglobuline Gli anticorpi Ig. G sono la base della protezione a lungo termine contro i microrganismi. Le Ig. G sono le uniche immunoglobuline che possono passare attraverso la placenta e forniscono protezione al feto durante la gravidanza e al neonato durante il primo mese di vita. - Ig. E : sono associate allergie, alle malattie allergiche e alle infezioni parassitarie. - Ig. D : ruolo non ancora ben definito. Rappresentano circa lo 0, 25% delle Ig. - Ig. M : prodotti alla prima risposta dell’organismo ad una nuova infezione o ad un nuovo antigene estraneo, fornendo una protezione a breve termine. - Ig. A : 15% delle Ig. Sono presenti anche in saliva, lacrime, secrezioni gastriche e respiratorie e latte materno. Le Ig. A forniscono protezione contro le infezioni delle mucose. Passando con l’allattamento dalla madre al neonato, forniscono una protezione al tratto gastrointestinale del bambino.

Ipogammaglobulinemia La concentrazione delle immunoglobuline aumenta progressivamente fin dalla nascita. La diminuzione della sintesi di immunoglobuline è clinicamente associata ad una ridotta resistenza alle infezioni. Si distinguono deficit immunitari: • primitivi (globali o parziali) a • secondari (a infezioni, neoplasie, trattamento con farmaci, …) globuline Elettroforesi: È facilmente riconoscibile quando riguarda le tre classi; il contrario se l’immunodeficienza è selettiva È quindi necessario integrare con altri esami, es: conteggio e classificazione in sottopopolazioni dei linfociti circolanti

Gammapatia policlonale La stimolazione di numerosi cloni di plasmacellule da parte di antigeni o virus epatotropi induce l’incremento di diverse classi di Immunoglobuline All’elettroforesi le gammapatie policlonali sono caratterizzate da un incremento diffuso ed eterogeneo della frazione a In alcuni casi nelle malattie infettive si può avere aumento isolato di una classe di immunoglobuline, che non è diagnostico ma può contribuire alla diagnosi differenziale globuline Ig. M: fase precoce di infezione Ig. G: contatto con un antigene già noto Ig. A: danno epatico (alcool, contraccettivi orali)

GAMMOPATIA MONOCLONALE Ø Le gammopatie monoclonali sono un gruppo di malattie caratterizzate da una eccessiva produzione di immunoglobuline da parte delle plasmacellule del midollo emopoietico. Ø Il termine di Gammopatia si riferisce al fatto che le immunoglobuline sono evidenziate per la maggior parte nella regione gamma dell'elettroforesi proteica, che in questi casi presenterà il cosiddetto "picco", conseguenza dell'eccesso di immunoglobuline. Ø Il termine monoclonale indica che queste proteine sono prodotte tutte da un solo clone di plasmacellule e sono uguali fra di loro, a differenza delle normali immunoglobuline che sono policlonali

COMPONENTI MONOCLONALI Ø La presenza di una CM definisce la condizione clinica di Gammopatia monoclonale (GM); tuttavia, l’assenza di CM nel siero e/o nelle urine non esclude la condizione clinica di GM. Ø Una componente monoclonale (CM o paraproteina) è un’immunoglobulina (intera o una sua parte) secreta da un singolo clone di cellule B in espansione, che viene evidenziata al tracciato elettroforetico sierico o urinario come una proteina singola, migrante in una specifica zona del tracciato stesso. Ø La tecnica elettroforetica permette di evidenziare l’omogeneità molecolare della proteina e di quantificarla; le tecniche di immunofissazione e/o di immunosottrazione permettono di tipizzarla immunologicamente, definendo il tipo di catena pesante e leggera che la compongono.

RILEVANZA CLINICA • La maggior parte delle CM (>50%) viene classificata come MGUS (Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance) ma è considerata comunque una condizione di malignità. • Una percentuale prossima al 35% delle CM ha una diagnosi di mieloma multiplo (MM) o di altre patologie correlate (mieloma asintomatico, plasmocitoma solitario, linfoma) • ~10% è associata alla diagnosi di AL-amiloidosi (AL). • Una piccola percentuale (<5%) è associata a patologie rare, quali la crioglobulinemia Le conseguenze per l’organismo della presenza di una CM sono molto variegate e spaziano dagli effetti causati dal clone plasmacellulare in evoluzione neoplastica (anemia, insufficienza renale, lesioni ossee) agli effetti causati dall’accumulo in circolo di una proteina tossica (amiloidosi, neuropatie periferiche, malattia da deposizione di catene leggere) fino a nessun effetto rilevabile, ma alla presenza di una condizione di rischio indefinito.

METODOLOGIE • • • Elettroforesi sieroproteica Tipizzazione delle CM sieriche Quantificazione della CM sierica l’immunofissazione urinaria Misura immunochimica delle catene leggere libere delle immunoglobuline nel siero (S-FLC)

ASPETTI METODOLOGICI E SIGNIFICATO CLINICO ELETTROFORESI SIEROPROTEICA • L'elettroforesi delle proteine sieriche permette di valutare i livelli quantitativi di 5 proteine sieriche: l'albumina e le globuline α 1, α 2, β e γ. Nei pazienti con gammopatia monoclonale, queste 5 proteine sieriche presentano delle alterazioni caratteristiche. • L’elettroforesi delle sieroproteine (S-EF) rappresenta l’esame di elezione per la rivelazione delle CM sieriche e per la loro quantificazione, essendo in grado di rilevare l’omogeneità molecolare della proteina. • Qualunque sia la tecnica prescelta (gel di agarosio o elettroforesi capillare) è importante che il metodo adottato sia ad elevata risoluzione, raggiungendo una sensibilità <1 g/L. • S-EF viene effettuata sia a scopo di screening per evidenziare la presenza di una CM, che durante il successivo inquadramento diagnostico e il monitoraggio dei pazienti con GM, sia per la quantificazione della CM che per evidenziare alterazioni qualitative della CM rispetto ai quadri precedenti Albumina 3. 5 – 5. 4 g/d. L 1 0. 2 – 0. 4 g/d. L 2 0. 5 – 0. 9 g/d. L b 0. 6 – 1. 1 g/d. L 0. 8 – 1. 5 g/d. L

ELETTROFORESI SIEROPROTEICA

ELETTROFORESI SIEROPROTEICA

ELETTROFORESI SIEROPROTEICA In alternativa la separazione può essere effettuata mediante elettroforesi capillare, nel qual caso la composizione percentuale delle proteine viene determinata senza colorazione, misurando direttamente l’assorbimento della luce da parte delle proteine nella zona della radiazione ultravioletta.

ASPETTI METODOLOGICI E SIGNIFICATO CLINICO TIPIZZAZIONE DELLE CM SIERICHE (Immunofissazione) • L’immunofissazione combina la migrazione elettroforetica con la precipitazione selettiva mediante l’uso di antisieri specifici. Il significato da attribuire alla rilevazione di una CM dipende dalla valutazione clinica del paziente al momento della rilevazione e dal monitoraggio nel tempo della progressione della CM. • La tipizzazione (o caratterizzazione immunologica) della CM sierica (S-IFE), effettuata tramite immunofissazione su gel d’agarosio o per sottrazione in elettroforesi capillare, ha lo scopo di confermare la natura immunoglobulinica e la monoclonalità della banda evidenziata dalla S-EF. Consente anche l’attribuzione della catena pesante e leggera dell’immunoglobulina coinvolta. È inoltre in grado di mettere in evidenza anche CM non rilevabili dal tracciato elettroforetico, perché di lieve entità o comigranti con altre proteine presenti fisiologicamente; questa capacità è maggiormente attribuibile all’immunofissazione, essendo questa una tecnica dotata di sensibilità più elevata rispetto all’immunosottrazione. • S-IFE deve essere effettuata obbligatoriamente al primo riscontro di una CM, in quanto il tipo di immunoglobulina coinvolta fornisce elementi utili ai fini diagnostici e prognostici.

TIPIZZAZIONE DELLE CM SIERICHE (IMMUNOFISSAZIONE) • La tipizzazione (o caratterizzazione immunologica) della CM sierica (S-IFE), effettuata tramite immunofissazione su gel d’agarosio per confermare la presenza della CM e determinare quali catene pesanti (g, e m) o leggere (k o l) costituiscono l’Ig rilevata sul tracciato. • La tipizzazione delle CM del siero mediante IFE avviene su lastrine di gel d’agarosio in cui il campione viene dapprima sottoposto all’elettroforesi e poi fatto reagire con gli antisieri specifici per le catene pesanti e leggere delle Ig. • Il profilo elettroforetico del siero ottenuto dopo l’immunoprecipitazione è confrontato con quello del campione non trattato permettendo in tal modo di identificare la CM per differenza.

TIPIZZAZIONE DELLE CM SIERICHE (IMMUNOFISSAZIONE)

QUANTIFICAZIONE DELLA CM SIERICA Il modo più corretto di misurare la CM sierica è per proporzione diretta con la concentrazione delle proteine totali sieriche dopo delimitazione del picco monoclonale nel tracciato elettroforetico. L’accuratezza di questa modalità non è però ottimale in quanto influenzata dall’operatore ed anche perché le due tecniche separative disponibili (gel di agarosio ed elettroforesi capillare) presentano differenze non trascurabili. La quantificazione della CM è un parametro cardine per la gestione del paziente con GM in quanto in tutte le malattie secernenti è un indice della massa tumorale; essa è necessaria nella diagnostica differenziale, nella stratificazione del rischio e nella valutazione della risposta alla terapia.

RILEVANZA CLINICA

DETERMINAZIONE DELLA PROTEINA DI BENCE JONES La proteina di Bence Jones è costituita dalle catene leggere libere monoclonali distaccate dalla catena pesante prodotte in eccesso dal clone plasmacellulare e presenti nelle urine. Le PBJ sono diverse dalle catene leggere “usuali” presenti nel nostro organismo dato che: 1) le PBJ sono libere, mentre le normali catene leggere sono legate alle pesanti nel formare l’anticorpo; 2) le PBJ sono monoclonali (geneticamente uguali), mentre le normali catene leggere sono policlonali. La PBJ può essere rilevata nel sangue o nelle urine con esami di laboratorio. Le linee guida raccomandano di utilizzare per la ricerca della PBJ l’immunofissazione urinaria, l’unico metodo con il quale si possono accertare le due caratteristiche della PBJ, cioè la monoclonalità e l’assenza della catena pesante.

DETERMINAZIONE DELLA PROTEINA DI BENCE JONES Una volta accertata la sua presenza, la quantificazione di PBJ deve essere effettuata su un campione di urina temporizzato (24 ore) per scansione densitometrica del picco monoclonale del tracciato elettroforetico urinario in rapporto alle proteine totali urinarie. La determinazione della PBJ è essenziale all’interno dello screening per discrasie plasmacellulari quando persiste il sospetto clinico di GM e gli esami su siero sono negativi; è necessario eseguirla per la diagnosi di GM e nella verifica della risposta alla terapia nel MM.

MISURA DELLE CATENE LEGGERE LIBERE NEL SIERO Nel 2001 è stato proposto un metodo per la misura immunochimica delle catene leggere libere delle immunoglobuline nel siero (S-FLC-serum free light chain assay). La sua introduzione ha consentito di ottenere un parametro quantitativo utile sia alla diagnosi che per il monitoraggio delle condizioni in cui la CM è difficilmente evidenziabile e misurabile (AL, MM non secernente/oligosecernente). La misura di S-FLC è prevista nello screening delle GM, nella stratificazione del rischio e nella valutazione della risposta alla terapia. L’analisi delle catene leggere libere accelera l’individuazione della risposta alla terapia poiché le catene leggere hanno un’emivita (3 -5 ore) più breve rispetto alle immunoglobuline intatte (circa 21 giorni). Questi dosaggi sono automatizzati e quindi richiedono poco tempo, inoltre sono in grado di riconoscere anche livelli appena aumentati delle catene quando non sono rilevabili né con la S-EF né con l’immunofissazione.

ESAMI DA ESEGUIRE AL PRIMO RISCONTRO • • • S-EF è l’esame di screening per le GM e questo è un esame di laboratorio molto richiesto. Il riscontro di una CM non è un evento così raro nella pratica del laboratorio clinico, di conseguenza è necessario una corretta gestione del paziente. La questione di quali esami eseguire nello screening delle GM è stata affrontata in diversi documenti internazionali:

Modulo di richiesta indagini biochimiche Proteine specifiche Elettroforesi delle proteine

Enzimi • • • Enzimi che catalizzano una determinata reazione biochimica. Enzimi coinvolti nella cascata della coagulazione, che possiedono un precisa funzione nel sangue. Enzimi che compaiono nel sangue accidentalmente e la loro determinazione è importante nella diagnosi. In caso di un danno tissutale ad esempio, si osserva un aumento dell’attività di questi enzimi nel siero. L’aumento dell’attività enzimatica è proporzionale, in maniera grossolana, alla dimensione del danno tissutale

Enzimi e danno tissutale • In caso di un danno tissutale ad esempio, si osserva un aumento dell’attività di questi enzimi nel siero. • Alanina aminotrasferasi ( ALT). La sua presenza nel siero indica in generale una danno epato-cellulare Fosfatasi alcalina: aumenta nella colestasi epatica e marca un’attività osteoblastica in patologie ossee Amilasi: indica un danno cellulare nella pancreatite acuta Aspartato aminotrasferasi: indica un danno muscolare ad esempio nell’infarto del miocardio Creatina chinasi: infarto del miocardio acuto g -glutamil transpeptidasi: indica un danno epatico lipasi: indica un danno cellulare nella pancreatite acuta • • •

Correlazione tra localizzazione dei diversi enzimi e loro uso diagnostico

Enzimogrammi d’organo • Non tutti gli enzimi sono marcatori di danno tissutale con la stessa accuratezza, sensibilità e specificità. • Un primo fattore è la diffusione dell’enzima: ad es. un aumento della LDH può essere attribuito ad un danno muscolare, piuttosto che epatico etc. • Al contrario un aumento della colinesterasi o della lipasi sono da riferire esclusivamente a fegato e pancreas.

• Un altro fattore discriminante è rappresentato dalla massa del tessuto o dell’organo danneggiato insieme al gradiente tra concentrazione intra ed extracellulare. • Un fattore discriminante in termini di gravità della lesione è la localizzazione intracellulare degli enzimi

Isoenzimi • Alcuni enzimi sono presenti nel plasma in due o piu’ forme molecolari, isoenzimi. • Essi pur avendo strutture diverse, svolgono la stessa funzione catalitica. • Isoenzimi diversi possono derivare da tessuti diversi e la loro rivelazione specifica può fornire indizi sul sito della patologia.

Isoenzimi • Gli isoenzimi della fosfatasi alcalina permettono di distinguere tra patologia ossea ed epatica, ad esempio nei quali si sospetta la presenza di metastasi di tipo osseo o epatico. • L’isoenzima della creatin chinasi (CK-MB) è utilizzato nella determinazione precoce dell’infarto del miocardio. • Il muscolo cardiaco contiene una quantità maggiore di questo isoenzima rispetto al muscolo scheletrico, livelli alti di CK-MB indicano la presenza di un infarto del miocardio.

Infiammazione • L’infiammazione, o flogosi è un meccanismo di difesa, non specifico, innato che rappresenta una risposta dell’organismo ad uno stimolo che provoca un danno cellulare. • Diversi stimoli esogeni ed endogeni possono causare danno cellulare, innescando nei tessuti vascolarizzati un complesso di reazioni che nel loro insieme prendono il nome di infiammazione, il cui obiettivo è eliminare o circoscrivere le cause della lesione ed avviare i meccanismi riparativi.

Infiammazione • In base alla durata del tempo, l’infiammazione può essere distinte in: – Acuta: di breve durata (da pochi minuti a pochi giorni), caratterizzata dalla formazione di un essudato costituito da lipidi, proteine plasmatiche (edema) e dalla migrazione ed accumulo di leucociti, prevalentemente neutrofili, nella sede di lesione; – Cronica: di lunga durata (giorni, mesi, anni), caratterizzata dalla presenza di linfociti e macrofagi, da proliferazione di vasi sanguigni, da fibrosi e necrosi tissutale.

Infiammazione • L’infiammazione può restare localizzata nella sede iniziale oppure può accompagnarsi ad una reazione sistemica accompagnata da febbre, malessere, modificazioni ematologiche e funzionali in rapporto alla sede del processo essere suddivisa in diverse fasi, ciascuna caratterizzata da mediatori che regolano le risposte vascolari e cellulari: – vasocostrizione- che interessa arteriole delle zone colpite ed è stimolata dall’adrenalina e dalla noradrenalina, mediatori chimici dell’infiammazione; – Vasodilatazione- interessa le arteriole e determina un aumento del flusso ematico, che è causa di calore ed arrossamento. – E’ indotta dalle istamine che, insieme alle piastrine secernono serotonina, mediatore del dolore. – Nel tessuto infiammatorio vengono, inoltre richiamate proteasi plasmatiche, che amplificano il segnale mediante sintesi a cascata, e vari mediatori cellulari.

Infiammazione • Essudazione- l’aumento della permeabilità del microcircolo determina la fuoriuscita di liquido ricco di proteine all’esterno dei vasi, nello spazio interstiziale dei tessuti, definito essudato. • Questo determina stasi, caratterizzata da un aumento della concentrazione dei globuli rossi, che asua vota determina, un aumento della viscosità del sangue ed un rallentamento della circolazione; la stasi innesca la reazione successiva; • Diapedesi- i g. bianchi fuoriescono dai vasi per raggiungere il tessuto danneggiato, seguendo il gradiente chimico di concentrazione (chemiotassi). Vengono reclutati granulociti neutrofili e monociti (che si trasformano poi in macrofagi) che fagocitano i batteri e degradano il tessuto; • Iperemia passiva- indotta dal rallentamento della velocità del sangue nel microcircolo. Il sangue, scorrendo meno velocemente tende a coagulare; • Guarigione- in seguito al riassorbimento dell’essudato, si può avere la rigenerazione tissutale, caratterizzata dalla sostituzione di cellule e tessuto danneggiato.

Si possono osservare variazioni caratteristiche nella concentrazione di alcune proteine plasmatiche in seguito a intervento chirurgico, a trauma, durante processi infettivi o durante lo sviluppo di tumori. “proteine della fase acuta” La risposta delle proteine alla fase acuta è un aumento o una diminuzione della produzione (principalmente da parte del fegato) di alcune proteine citochine Evento traumatico Infiammazione TNF proteine della fase acuta

Esistono diversi tipi di reazioni infiammatorie, differenziabili in base a: • Agente scatenante • Componenti reclutati nella difesa immunitaria • Mediatori prodotti • Cellule accumulate al sito della reazione

• In seguito ad uno stimolo infiammatorio, le citochine liberate, in particolare IL-6, IL-1 e TNF -a, inducono a livello epatico un’alterata sintesi di specifiche proteine plasmatiche. • Gli indicatori più comunemente utilizzati nella pratica clinica sono la PCR e la VES.

I diversi tipi di reazioni infiammatorie

Risposta metabolica al trauma Può considerarsi una risposta fisiologica di protezione Comprende due fasi: 1) Fase di deflusso (ebb-phase): è generalmente breve e corrisponde allo shock clinico, derivante da una ridotta perfusione del tessuto 2) Fase di flusso (flow-phase): può avere una durata di giorni o settimane. Il metabolismo è alterato per garantire che l’energia prodotta sia a disposizione del tessuto interessato, a scapito del muscolo e delle riserve di grasso Cambiamento metabolico Conseguenze Aumento della glicogenolisi e della glucogenesi Aumento del glucosio ematico da usare come substrato energetico Aumento della lipolisi Aumento degli acidi grassi liberi da usare per fornire energia Aumento della proteolisi Aumento di amminoacidi che sono catabolizzati per produrre energia o usati per la sintesi dei tessuti

Risposta metabolica al trauma • • • Se l’ampiezza della fase di deflusso è lieve o moderata, i pazienti avranno un passaggio privo di complicanze nella fase di flusso; se l’ampiezza della fase di deflusso è rilevante, i pazienti vanno incontro ad una sindrome da risposta infiammatoria sistemica (SIRS) La SIRS è uno stato patofisiologico caratterizzato dall’attivazione di molti mediatori infiammatori e dall’alterazione di molti parametri biochimici

Risposte sistemiche al trauma (SIRS) Fasi della SIRS : 1) Attivazione del complemento 2) Citochine 3) I derivati dell’acido arachidonico (prostaglandine prostacicline e trombossani) 4) La chemiotassi

Attivazione del complemento • Il complemento insieme agli anticorpi, è un elemento essenziale del sistema immunitario nei meccanismi di difesa umorale contro gli agenti infettivi. • E’ costituito da una 30 di proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari, hanno la capacità di opsonizzare i patogeni e di indurre una serie di reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni. Si conoscono tre vie di attivazione del complemento: • La via classica fa parte dell’immunità umorale determinata dall’interazione antigene anticorpo specifica quindi del danno tissutale • La via alternativa e la via della lectina fanno parte dell’immunità innata e non hanno bisogno dell’interazione con l’antigene per essere attivate

Affinchè il complemento svolga la sua funzione battericida e citolitica, le tre diverse vie convergono in una via finale comune che porta alla attivazione del complesso di attacco alla membrana o MAC (membrane attack complex) costituita da una struttura multiproteica lipofila a forma di poro che provoca la lisi cellulare.

Le citochine sono messaggeri solubili (in genere glicoproteine) prodotte sia da cellule immunitarie che non immunitarie. Regolano il sistema immunitario, la crescita e la differenziazione cellulare e la risposta infiammatoria. Nell’infiammazione le citochine vengono prodotte dai macrofagi attivati e dalle cellule endoteliali. Esse agiscono come secondi mediatori e causano la sintesi di molecole di adesione, attivano le proteine della fase acuta, etc. Le citochine si classificano in: • interleuchine (IL) • interferoni (INF) • Fattori di necrosi tumorale (TNF) • Fattori di crescita (GF) e colony-stimulating factors (CSF) Le citochine essenziali per l’infiammazione sono IL 1, IL 6 e il TNFa

I derivati dell’acido arachidonico (prostaglandine, leucotrieni) L’acido arachidonico è prodotto dai fosfolipidi di membrana per azione della fosfolipasi A.

La chemiotassi I principali mediatori coinvolti nella chemiotassi sono: • C 5 a • Peptidi N-formilati • LTB 4 (Leukotriene B 4) • PAF (platelet activating factor) La chemiotassi si realizza secondo queste tre fasi • Ferma adesione, mediante integrine (ICAM, VCAM), all’endotelio vascolare • Migrazione attraverso i gap dell’endotelio • Migrazione attraverso il tessuto secondo un gradiente chemiotassico

I mediatori chimici, una volta attivati portano ad una serie di eventi a cascata tipica dell'Infiammazione, che possiamo sintetizzare in: • Calor: da vasodilatazione • Rubor: da vasodilatazione • Tumor: da aumento della vasopermeabilità • Dolor: da edema e mediatori flogistici specifici • Functio lesa: effetto finale della risposta infiammatoria

Sintomi clinici correlati alla risposta infiammatoria sistemica (SIRS) Le risposte sistemiche possono essere: Attivate da IL 1, IL 6 e TNFa • Alterazione della temperatura corporea (mediante sintesi di PGE 2) • Secrezione di ACTH che stimola la corteccia surrenale a produrre corticosteroidi e la deposizione di glicogeno nel fegato, l’induzione di aumento di lipidi nel fegato e di acidi grassi liberi nel siero • Effetto sul sistema emopoietico: riduzione dell’eritropoiesi, aumentata produzione di neutrofili e trombociti Attivate da varie citochine • Attivazione epatica della risposta della fase acuta

Risposta della fase acuta La risposta delle proteine alla fase acuta è rappresentata da un aumento a carico del fegato di alcune proteine plasmatiche e la diminuzione di altre. Tale risposta è stimolata dal rilascio dei mediatori chimici (citochine come IL-1 e IL-6) e del TNF a dall’aumento della concentrazione di cortisolo e glucagone

Il quadro proteico elettroforetico (QPE) nella fase acuta • 1 - globuline aumentano precocemente, per l’aumento di a 1 -antitripsina • 2 -globuline aumentano subito dopo, per l’aumento di aptoglobina e ceruloplasmina • Invece, l’albumina e la transferrina diminuiscono nalla fase acuta dell’infiammazione, in quanto, la maggiore permeabilità indotta dalla flogosi ne induce il passaggio agli spazi extravascolari. Quindi sono definite “proteine negative” della fase acuta: • Albumina • Transferrina

La risposta delle proteine della fase acuta • L’aumento della proteina C reattiva e del complemento contiene ed elimina l’infezione; • l’aumento dei fattori della coagulazione evita l’eccessiva perdita di sangue; • gli inibitori delle proteasi prevengono la diffusione della necrosi tissutale quando gli enzimi lisosomiali vengono rilasciati dalle cellule danneggiate nel sito della lesione. Tipo di proteina Aumento Inibitori delle proteasi 1 -antitripsina 2 -macroglobulina Proteine della coagulazione Fibrinogeno Protrombina Fattore VIII Plasminogeno Proteine C 1 s del complemento C 2, B, C 3, C 4, C 56, C 1 INH Varie Aptoglobulina Ceruloplasmina Proteina C reattiva (PCR) Proteina A nel siero Diminuzione Albumina HDL LDL

La diagnosi dell’infiammazione Per la diagnosi dell’infiammazione si effettua: • Misurazione della temperatura corporea • Conta dei globuli bianchi ed esame della formula, che permette di stabilire se l’infiammazione è provocata da agenti batterici o virali, se si tratta di un processo infiammatorio cronico o di una reazione allergica. • Analisi delle proteine di fase acuta o di marcatori non proteici, come la VES o la PCR, può essere utile per monitorare il progredire della patologia o l’effetto della terapia.

Conta dei globuli bianchi ed esame della formula • infiammazioni da agenti batterici: leucocitosi (> 15. 000) con neutrofili > 80% • Infiammazioni da virus: WBC normali o poco aumentati, in genere linfocitosi • Infiammazioni croniche: WBC normali o poco aumentati • Reazioni allergiche o parassitosi: WBC normali o poco aumentati, eosinofilia

Indici Biochimici della fase acuta dell’infiammazione • Monitoraggio infiammatorio: della fase acuta del processo • Dosaggio della PCR (proteina C reattiva) • Valutazione della VES (velocità di eritrosedimentazione)

PCR (proteina C reattiva) • E’ la classica proteina della fase acuta, è costituita da 5 catene identiche = pentaxina, proteine leganti il calcio, con proprietà di difesa; • è capace di legarsi ad un elevato numero di sostanze, sia esogene che endogene e quindi di facilitare la loro rimozione dal circolo (opsonizzazione). • La sua produzione è indotta durante l’infiammazione acuta e cronica (le endotossine batteriche sono i più potenti stimoli alla produzione di PCR), ma anche in alcune neoplasie (linfoma non-Hodgkin’s) e nelle malattie autoimmunitarie e da immunocomplessi.

Le variazioni della PCR (proteina C reattiva) : Un aumento di PCR è sempre indice di patologia o di infiammazione acuta o cronica, malattia autoimmunitaria, necrosi tissutale e cancro; mentre valori normali non escludono la presenza di piccoli focolai infiammatori, in cui la risposta della fase acuta è minima. Valori di Riferimento • adulti e bambini = 0, 06 - 10 mgL • neonati < 0, 06 mgL • bambini fino ad 1 mese < 1, 6 mgL

Il grado di aumento della PCR riflette la massa o l’attività del tessuto infiammato: • PCR tra 10 e 50 mgL = leggera infiammazione, infezioni virali • PCR tra 50 e 100 mgL = malattia più severa, infezioni da Gram+ • PCR > 100 mgL = infezione batterica da Gram-

VES (velocità di eritrosedimentazione) Nell’infiammazione la VES aumenta perché l’aumento delle a-globuline eo delle immunoglobuline favorisce la formazione di macroaggregati con i globuli rossi, che, pertanto, sedimentano più velocemente. E’ un indicatore molto sensibile della fase acuta (la VES aumenta dopo circa 24 h e diminuisce 6 -8 giorni dopo la risoluzione della fase acuta). E’ alterata anche in tutte le situazioni di aumento di Ig, e nelle disproteinemie. Inoltre, nelle forme di natura non neoplastica l’aumento delle proteine di fase acuta è in genere brusco e limitato nel tempo. Il riscontro di una reazione di fase acuta che si protrae nel tempo depone fortemente per un processo neoplastico.

VN (dopo 1 h): < 20 mm nelle donne < 15 mm nei maschi.

Il dosaggio di PCR e VES può essere utilizzato per monitorare il progredire della patologia infiammatoria o l’effetto della terapia Misurando la Proteina C reattiva nel siero (PCR): la cui concentrazione cambia molto rapidamente, quindi può essere usata per il controllo giornaliero Valutando la velocità di sedimentazione degli eritrociti (VES): è una misura indiretta dell’aumento delle immunoglobuline. Varia lentamente e viene utilizzata per seguire l’andamento del processo infiammatorio al passare delle settimane

Amiloide sierica A (SAA) • Apolipoproteina (lega le HDL), prodotta come proteina della fase acuta (aumenta di 100 -1000 volte) • Significato fisiologico non noto • Metodo di determinazione: RIA, ELISA, immunonefelometria, immunoturbidimetria • Significato clinico: parametro sensibile, paragonabile alla PCR, per monitorare la fase acuta della risposta infiammatoria, soprattutto per distinguere meglio le risposte minime • E’ un indice molto sensibile di rigetto di trapianto