Reao em Cadeia da Polimerase A PCR um

Reação em Cadeia da Polimerase

A PCR é um método rápido e fácil para a geração de cópias ilimitadas de qualquer fragmento de DNA “Multiplicar um trecho específico do DNA (gene ou parte dele, regiões supervariáveis, etc), utilizando desoxinucleotídeos como monômeros, até um ponto em que sua concentração seja tão alta que possa ser facilmente detectável”

É o método de rotina para isolar rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura complexa de sequências genômicas ou de c. DNAs.

Clonagem

1976: Havia sido descoberta a DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus 1984: PCR foi apresentada pela primeira em um encontro científico Publicações: Mullis and Faloona, 1987 Saiki at al. 1988 Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park”

Termociclador, 1990

Por que usar PCR? Amplificar sequências específicas de ácidos nucleicos “in vitro” (“Xerocar” DNA) PCR permite que segmentos de DNA (com menos de 3000 pares de bases) sejam amplificados em cerca de um milhão de vezes. As amostras amplificadas podem ser usadas para determinação da sequência de nucleotídeos, clonagem, transfecção, RFLP, análise de polimorfismo, etc. Milhões de cópias de DNA podem ser feitas em algumas horas.

Por que usar PCR? Clonagem de DNA ou c. DNA Mutagênesis Identidade genética (fingerprinting) Diagnóstico pré-natal Deteção de patógenos Sequenciamento de DNA genômico ou c. DNA Análise de variações em seqüências alélica Análise de expressão gênica (m. RNA)

Princípios Básicos Consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos comuns ao processo de replicação natural do DNA.

Componentes essenciais para uma Reação de PCR: DNA polimerase termoestável Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA Desoxinucleotídeos trifosfato (d. NTPs) Cátions divalentes: toda DNA polimerase requer cátions divalentes, usualmente Mg 2+ Tampão para manter o p. H Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl) Template de DNA

ETAPAS DA REAÇÃO DE PCR É um processo dinâmico, com três etapas essenciais: Desnaturação por aquecimento Pareamento dos iniciadores à seqüência alvo Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável Todas as três etapas são feitas num mesmo tubo, mas em diferentes temperaturas.

O MÉTODO DE PCR 3 temperaturas diferentes são usadas na reação de PCR: A temperatura em torno de 94 a 95°C é usada para desnaturar o DNA a ser amplificado. A temperatura em torno de 54 a 55°C é usada para o anelamento do primer com a sequência alvo. A temperatura em torno de 72°C é usada para extensão da sequência a ser amplificada.

ETAPAS DO MÉTODO DE PCR Cada uma das fitas do DNA serve como template para síntese de uma nova fita. 1 a. Etapa 2 a. Etapa 3 a. Etapa

Os “primers” presentes na reação paream com as novas fitas na região de complementariedade antiparalela entre “primer”“template”, garantindo o aumento exponencial do número de novas fitas. Primer Seqüência Alvo Novo DNA

A quantidade de produto dobra a cada ciclo, assim ao final de 30 ciclos, tem-se 228 vezes (270 milhões de vezes) a amplificação da discreta seqüência inicial.

ETAPAS DO MÉTODO DE PCR DESNATURAÇÃO: As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por PONTES DE HIDROGÊNIO As duas fitas são ANTIPARALELAS O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio

1961 - Marmur e Doty descreveram a DESNATURAÇÃO E A RENATURAÇÃO do DNA Aumento de temperatura ou Extremos de p. H Na PCR as fitas são desnaturadas por aquecimento. O aquecimento aumenta a agitação térmica das moléculas propiciando a quebra das pontes de H

DESNATURAÇÃO: Separação das fitas é denominada “FUSÃO” da molécula de DNA - “MELTING” MELTING POINT: temperatura na qual a metade da estrutura do DNA em dupla hélice é desfeita.

A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam. Temperatura de desnaturação, ou “melting point” (Tm), é a temperatura na qual ocorre 50% de desnaturação. Desnaturação e renaturação permitem a realização de PCR

DESNATURAÇÃO: Temperatura e Tempo de desnaturação: Tipicamente, 94 o. C durante 30 segundos. . Esta temperatura de separação irreversível das fitas é vários graus acima do Tm (tipicamente, 92 o. C para DNA com 50% de G+C). A temperatura de desnaturação será mais alta quanto maior for conteúdo de G+C da seqûência alvo.

ETAPAS DO MÉTODO DE PCR ANELAMENTO DOS PRIMERS: Qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers).

ANELAMENTO DOS PRIMERS: Oligonucleotídeos com cerca de 20 nucleotídeos São seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano. Os primers são complementares às extremidades da seqüência que se deseja amplificar.

O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo na template se faz por meio de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick: A T C G

ANELAMENTO DOS PRIMERS: O DNA é uma molécula com polaridade: uma extremidade 5’-P e uma extremidade 3’-OH O primer para PCR tem extremidade 3’- OH O primer geralmente não é fosforilado. A SEQUÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO 5’ 3’

primer DNA pol deoxinucleotídeo trifosfato Template

ANELAMENTO DOS PRIMERS: Cada uma das novas fitas de DNA extendida a partir do “primer” serve como template para síntese de outra nova fita. Os “primers” presentes na reação fazem o pareamento com as novas fitas, na região de complementariedade antiparalela entre “primer”- “template”. Isso garante a aumento exponencial do número de novas fitas. Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a seqüência dos primers na extremidade 5’ e a seqüência complementar aos primers na extremidade 3’ forward reverse “primers” complemento dos “primers”

ANELAMENTO DOS PRIMERS: A concentração ótima de “primer” é de 0, 1 a 0, 5 µM Ambos os membros do par devem ser usados na mesma concentração Excesso de “primers” induz aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de “primers”

Primers : Oligonucleotídeos Iniciadores Filamentos de ss. DNA ou RNA que flanqueiam a seqüência alvo disponibilizando uma 3’OH livre para adição de um novo d. NTP pela Taq polimerase 10 pb a 30 pb - sempre escritos 5’ para 3’ Conteúdo de GC 50% Extremidade 3’ rica em G+C Extremidade 5’ rica A+T 1 par de primers - sense e anti-sense Evitar que haja homologia entre os primers Concentração em uma PCR convencional: 0. 1 a 0. 5 M

ETAPAS DO MÉTODO DE PCR EXTENSÃO DA NOVA CADEIA DNA POLIMERASES : POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’ Todas as DNA-POLIMERASES requerem para seu funcionamento: Molécula de DNA - molde “Primer” de oligonucleotídeo (iniciador) Magnésio d. NTPs

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA Concentração de enzima: 1, 0 a 2, 5 U por 100 L de reação Testar entre 0, 5 a 5 U por 100 L de reação Altas concentrações de enzimas podem resultar em amplificações inespecíficas A concentração de enzima depende também de outros parametros, como número de ciclos, temperatura de desnaturação, etc.

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA d. NTPs (deoxinucleotídeos trifosfato) Soluções estoques: 10 m. M, p. H 7. 0, – 20 o. C Concentração na reação: 10 a 200 µM de cada d. NTP Os quatro – d. ATP, d. CTP, d. GTP e d. TTP, devem estar iguais concentrações para evitar incorporações erradas Deve-se começar com 50 m. M de cada d. NTP. Estabilidade dos d. NTPs: 50% persiste íntegro após 50 ciclos de PCR A fidelidade e especificidade da PCR aumentam de forma inversa à concentração de d. NTPs.

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA Magnésio: As concentraçoes de Mg 2+ influenciam: o anelamento dos primers especifidade da reação formação de dímeros de primers especificidade e fidelidade da enzima Usualmente deve-se começar com 1, 5 m. M Concentração Ideal entre 0, 5 e 2, 5 m. M

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA Template: A quantidade de template a ser adicionada depende do tipo de material utilizado DNA genômico: 50 a 250 ng 1 mg de DNA genômico tem 3 X 105 moléculas de um gene único. O mesmo número de moléculas está presente em: - 10 ng de DNA genômico de levedura - 1 ng de DNA genômico de E. coli. - 1 -2 pg de plasmídeo - 2 pg de bacteriofago l

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA Temperatura de extensão: usualmente 72 o. C Nessa temperatura, há incorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo, dependendo da enzima, do tampão, do p. H, da concentração de sal, da natureza do DNA template Tempo de extensão: depende do tamanho do amplicon 1 minuto é suficiente para um amplicon de 1, 2 kb

EXTENSÃO DA NOVA CADEIA Número de ciclos: Depende do número inicial de moléculas alvo: 3 x 105 moléculas - 25 a 30 ciclos 1, 5 x 104 moléculas - 30 a 35 ciclos 1 x 103 moléculas - 35 a 40 ciclos 50 moléculas - 45 ciclos

DNA POLIMERASES UTILIZADAS EM PCR DNA polimerases: Todas sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um “primer”, através da incorporação de nucleotídeos do meio, na direção 5’ -> 3’, tendo como orientação para a incorporação dos nucleotídeos a informação contida na fita molde (template).

DNA polimerases utilizadas em PCR Todas sintetizam DNA na direção 5’-> 3’ As DNA polimerases usualmente têm também atividade exonucleásica: na direção 3’ -> 5’: uma atividade “proof reading” na direção 5’ -> 3’: atividade corretiva em que há necessidade de remoção de um segmento de DNA que está na “ frente” da enzima

DNA polimerase I de E. coli uma DNA polimerase mesófila

Fidelidade da Replicação Se a polimerase não pudesse corrigir erros haveria a inserção de 1 base errada a cada 104 bases incorporadas

Atividade proof-reading da enzima (exonuclease 3’ ->5’): reduz a taxa de erro para 1 base errada a cada 107 Sistema de reparo reduz a taxa de erro para 1 base errada a cada 109

DNA polimerases termoestáveis: DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq - polimerase) - a primeira a ser descoberta e a mais utilizada - DNA pol 5’->3’, Exonuclease 5’->3’. Mc. Henry et al 1997: DNA polimerase de Thermus thermophilus (r. Tth pol) similar à subunidade da DNA pol-III de E. coli. DNA polimerases podem adicionar uma base a mais na extremidade 3’ OH, independetemente da “template”. A probabilidade de adição é maior quanto maior a concentração de Mg 2+ e de enzima. A base a mais adicionada é quase sempre A.

DNA polimerases termorresistentes com atividade corretiva: Uemori et al. 1997: DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu) - forte atividade exonucleásica 3’->5’ (proof reading). Tli DNA polimerase: derivada do Thermoccocus litoralis. (Promega) Vent DNA polimerase: é a forma recombinante da Tli (New England Biolabs) Ambas têm atividade exonucleásica 3’--> 5’ e são mais termoestáveis que a Taq (meia vida de 6, 7 h a 95 o. C). Sintetizam fragmentos de até 13 kb. Deep. Vent DNA polimerase: extraída do Pyroccocus GB-D. (New England) outras. .

Nunca negligencie os controles !!!! Controles: - 1 tubo sem template - 1 tubo sem primers - 1 tubo apenas com o primer 1 - 1 tubo apenas com o primer 2 Boas práticas indispensáveis: - Descongelar os tampões e os d. NTPs completamente no gelo - Misturar no vortex ou batendo nos tubos - Centrifugar por 1 segundo antes de pipetar - Verificar sempre a calibração dos pipetadores

VISUALIZAÇÃO DE PRODUTOS DE PCR Amostra 100 bp 1 3 1 6 2 8 14 3 20 4 23 5 (+) 6 (-) 7 8

Regras Básicas Evitar contaminação Não esquecer dos controles negativos e positivos Separar área de pré-PCR da área pós-PCR Calcular e verificar volumes Adicionar o DNA por último Extração de DNA bem sucedida Verificar o programa de ciclagem de acordo com o experimento