ltalnos Genetika A DNS szerkezete s replikcija 1

Általános Genetika A DNS szerkezete és replikációja 1

A mai óra kulcskérdései • A kettőshélix felfedezése előtt hogyan kísérletesen, hogy az örökítőanyag a DNS ? bizonyították • Milyen korábbi adatok, ismeretek alapján hozták létre a kettős hélix modellt? • Hogyan adódik a DNS replikáció mechanizmusa a kettős hélix szerkezetből? • Milyen szabályszerűségek szerint történik az extranukleáris genetikai állományban tárolt információ áramlása ? • Milyen speciális mechanizmus felelős a kromoszómavégek replikációjáért és milyen egészségügyi következménye van, ha ez a folyamat valamilyen okból nem működik megfelelően ? 2

Az örökítőanyag - a DNS - szerkezetét és működésmódját 1953 -ban írta le James Watson és Francis Crick Munkájukat a következő előzményekre alapozhatták: - Az egyes tulajdonságokat öröklődő részecskék (gének) alakítják ki (Mendel) - A gének fehérjék szerkezetét befolyásolják, egy gén ~ egy enzim. (Beadle és Tatum) - A gének kromoszómákon vannak (Bridges) - A kromoszómák DNS-ből és fehérjékből állnak - Az örökítőanyag a DNS 3

A DNS örökítőanyag mivoltának bizonyítéka I. A transzformáció felfedezése (Frederick Griffith 1928) S törzs R törzs A Streptococcus pneumoniae virulens, S törzsével beoltott egerek tüdőgyulladásban elpusztulnak, az R törzzsel beoltottak túlélnek 4

A transzformáció felfedezése Griffith kísérlete, 1928 A hővel kezelt S törzs nem pusztítja el az egereket A hővel elölt S baktériumok és az élő nem -virulens R baktériumok keverékével beoltott egerek elpusztulnak Az utolsó kísérlet döglött egereiből élő S baktériumok tenyészthetők ki Az elölt baktériumok anyagából valami az R baktériumokat S-é alakította át (transzformálta) 5

A transzformáló anyag a DNS O. Avery, C. M. Mac Leod és M. Mc. Carty kísérlete, 1944 Ez a kísérlet igazolta először, hogy a gének DNS-ből állnak Az S sejtek komponensei közül egyedül a DNS az, amelyet elroncsolva az R sejtek nem alakíthatóak S formává, így az egér túléli a kezelést. Tehát a DNS a transzformáló anyag. 6

A DNS örökítőanyag mivoltának bizonyítéka II. (Hershey-Chase kísérlet, 1952) 35 S jelölt fehérje 32 P jelölt DNS A radioaktivitás a leváló üres fág fejekben észlelhető A radioaktivitás a baktériumokban észlelhető, majd a következő fág generációban is megjelenik 7

A DNS örökítőanyag mivoltának bizonyítéka II. (Hershey-Chase kísérlet, 1952) A Hershey-Chase kísérlet igazolta, hogy a fágok örökítő anyaga a DNS, nem pedig a fehérje A kísérlet kétféleképpen előkészített T 2 fágot használt. Az egyik esetén a fehérje burkot radioaktív kénnel (35 S) jelölték. A kén nem fordul elő a DNS-ben A másik esetben radioaktív foszforral (32 P) a DNS-t jelölték. A foszfor nem fordul elő a fehérjében Közvetlenül a fágfertőzés után a fágokat keveréssel és centrifugálással elválasztották a baktériumoktól Csak a 35 P injektálódott az E. coli-ba, jelezve, hogy a DNS az új fágok létrejöttéhez szükséges anyag 8

Néhány vírusnak RNS az örökítő anyaga Ennek bizonyítása dohány mozaik vírussal: 1. , Az RNS-ről eltávolították a fehérje burkot. 2. , Az egyik törzsből tisztított RNS-t egy másik törzsből tisztított fehérjeburokkal keverték össze. 3. , A „hibrid” vírussal levelet fertőztek. 4. , A levélből kinyert vírusok az RNS-t adó törzs tulajdonságait hordozták. 9

Mit kell „tudnia” a genetikai anyagnak? 1. , Rendelkeznie kell az információ tárolásának és működtetésének képességével 2. , Képesnek kell lennnie ezen információt pontosan megkétszerezni és változatlan formában továbbadni 3. , Rendelkeznie kell a változékonyság képességével A DNS ismert kémiai szerkezete túlságosan egyszerű felépítésűnek tűnt ahhoz, hogy a fenti feladatoknak megfelelhessen 10

A DNS szerkezete Mit tudtunk róla régen és ma? 11

A kettős hélix modell előzményei A DNS kémiai összetevői A DNS röntgen diffrakciós képe Chargaffszabályok Watson és Crick kettős hélix modellje 12

A DNS kémiai összetevői 13

A DNS kémiai összetevői A DNS kémiai felépítésének alapegysége a nukleotid. A nukleotid foszfátot, dezoxiribóz cukrot és négy szerves bázisból egyet tartalmaz. A négy bázis az adenin, a guanin, a citozin és a timin. A cukor és a bázis alkotta egység a nukleozid: dezoxiadenozin, dezoxiguanozin, dezoxicitidin, dezoxitimidin. A nukleotidok teljes kémiai neve: rövidítése dezoxiadenozin 5’-monofoszfát, d. AMP - A dezoxiguanozin 5’-monofoszfát, d. GMP -G dezoxicitidin 5’-monofoszfát, d. CMP -C dezoxitimidin 5’-monofoszfát, d. TMP -T 14

A Chargaff szabályok (1950) Kölönböző élőlényekből kivonható DNS összetételének vizsgálata érdekes törvényszerűségeket tárt fel. A törvényszerűségeket Erwin Chargaff ismerte fel: 1. Az élőlényekből származó DNS-ekben a pirimidin nukleotidok (T + C) mennyisége egyenlő a purin (A + G) nukleotidok mennyiségével 2. A T mennyisége egyenlő az A-val, és C mennyisége egyenlő G-vel Azonban A + T és C + G mennyiségek nem feltétlenül egyenlők, azok aránya jellemző az élőlényre amiből a DNS származik 15

Példák a Chargaff szabályokra 16

A DNS röntgen diffrakciós képe (R. Franklin és M. Wilkins, 1953) 17

A DNS (B forma) röntgen diffrakciós képe (R. Franklin és M. Wilkins, 1953) A röntgen diffrakcióval kapott adatok azt jelezték, hogy - a molekula fonálszerű - a fonál két párhuzamos szerkezetből áll - egyenletes átmérőjű - spirál alakú 18

A DNS térszerkezetét Watson és Crick oldotta meg l 953 -ban A modell kidolgozása során merészen összeillesztették a röntgen diffrakciós adatokat, a Chragaff szabályokat és a DNS és alkotórészeiről felhalmozódott kémiai ismereteket olymódon, hogy a modell eleget tehessen az örökítőanyag által támasztott követelményeknek 19

A DNS kettős spirál 20

A DNS elsődleges szerkezete: foszfodiészter kötés O H H O - O P OH O 5’ foszfát vég 3’ OH vég 21

A DNS elsődleges szerkezete: polinukleotid lánc A modellben a víztaszító bázisok belül, a cukor és foszfát csoportok kívül helyezkednek el Minden bázispár egy purint, (A vagy G) és egy pirimidint, (T vagy C) tartalmaz Az A-T párt 2, a G-C párt 3 hidrogénhíd stabilizálja A két szál komplementer (meghatározza és kiegészíti egymást) Az antiparallel irányultságot a cukor 5 3’ iránya adja 22

Lehetséges bázis párosodás a kettős spirálban Csak a purin - pirimidin párosodás felel meg a DNS szál röntgennel meghatározott átmérőjének Ugyancsak ez a kombináció felel meg Chargaff első szabályának 23

A DNS másodlagos szerkezete: kettős spirál (szalag modell) A pálcák a bázispárokat képviselik A szalagok a két antiparallel lánc cukorfoszfát gerincét képviselik A méretek angström-ben (1Å = 0, 1 nm) mutatják a távolságokat A spirál 10 bázisonként fordul csaknem pontosan 360 o-ot 24

A DNS kettős spirál létra modellje A létra modellen jól látszik, hogy a bázispárok létrafokként helyzkednek el a szerkezet belsejében A cukor gyűrű síkja majdnem merőleges a bázisok síkjára A víztaszító bázisok szoros egymásra fekvése a víz kiszorítása által erősen stabilizálja a szerkezetet A hidrofil cukor-foszfát gerinc kölcsönhat a sejt vízmolekuláival 25

A három dimenziós szerkezet jól szemlélteti az egymással ellentétes oldalon futó kis és a nagy barázdát A DNS-kötő fehérjék csak a barázdákban kapcsolódhatnak a bázisokhoz kis árok Jól látszik, hogy a víztaszító bázisok szorosan egymásra fekszenek ami erősen stabilizálja a szerkezetet nagy árok A DNS kettős spirál térkitöltő modellje 26

A DNS többféle másodlagos szerkezetet vehet fel Az élőlényekben és vizes oldatban a „B” forma a leggyakoribb, ebben a bázisok síkja majdnem merőleges a cukorfoszfát gerincre A B Z Dehidrált körülmények között egy tömörebb „A” forma jön létre, melyben a bázisok síkja megdől Hosszú GCGCGC. . ismétlődések a Z formát vehetik fel, amely balmenetes, zegzugos lefutású és megnyúlt 27

A DNS replikációja prokariótákban 28

A replikációval szembeni követelmények: 1. , Sokszor: Egyetlen ember egyedfejlődése több millió sejtosztódást igényel 2. , Gyorsan: 1000 nukleotid/másodperc (1000 nukleotid/perc sebesség mellett egy E. coli 106 bp méretű genomja 3 napig replikálódna! – sejtciklusa 20 perc) 3. , Pontosan: A genom másolásánál csupán 1/ 100 000 (10 -8) replikációs hiba történik, melynek 99%-át a javító rendszer utólagosan kijavítja. Az átlagos mutációs ráta a replikáció végeztével 10 -10 Vagyis a 109 bp genom-méretű emberi sejt átlagos osztódása során 0 -1 új mutáció keletkezik replikációs hiba folytán 29

A DNS replikáció jóslata "It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. " (Watson és Crick 1953, Nature cikk utolsó mondata) A DNS kettős spirál szerkezetéből közvetlenül adódik a megkettőződés mikéntje A bázispárosodás szigorú törvényéből az következik, hogy amennyiben a kettős spirál két szála zipzárként kettéválik, mindkét szál mintaként (templátként) szolgálhat egy új szál szintéziséhez, melynek során az eredeti szállal és egymással megegyező szerkezetek jönnek létre Ezzel magyarázatot nyer a az örökítőanyag pontos átadódása a sejtosztódás során A genetikai kódot a nukleotid sorrend adhatja 30

A cézium klorid (Cs. Cl) sűrűség grádiens ultracentrifugálás elve DNS oldat DNS Egyenletes sűrűségű Cs. Cl oldat kisebb sűrűségű Cs. Cl nagyobb sűrűségű Cs. Cl 105 x g gravitációs erő A centrifugálás során a DNS a fajsúlyának megfelelő sávban gyűlik össze 31

A szemikonzervatív replikáció bizonyítása: A Meselson-Stahl kísérlet (1958) A több generáción keresztül 15 N táptalajon tartott baktériumokból származó DNS nehéz sávot ad céziumklorid gradiens centrifugálással. A normál (14 N) táptalajon nevelt baktériumok DNS-e pedig könnyű sávot ad. Ha a 15 N-en tartott sejteket átteszik könnyű táptalajra, az első nemzedékben köztes, a második után könnyű és köztes sáv figyelhető meg a grádiensben. 32

A Meselson-Stahl kísérlet értelmezése A Meselson-Stahl kísérletben kapott eredmények csak szemikonzervatív DNS replikációval értelmezhetők egyetlen nehéz sáv a kiindulási nemzedékben egyetlen átmeneti sáv az első nemzedékben egy köztes és egy könnyű sáv a második nemzedékben 33

A DNS replikáció magasabb rendűekben is szemikonzervatív Herbert Taylor 1958 – bab gyökércsúcs sejtek Egy sejtgeneráció hosszan triciált (3 H) timidint tartalmazó tápoldatban tartott sejtek a radioaktív nukleotidot beépítik az új láncba, amit a kromoszómák autoradiogramja (fényképe) is jelez Ezután nem-radioaktív timidint tartalmazó tápoldatba áttéve egy újabb replikáció után az autoradiogramon csak az egyik testvér kromatida jelölődik (Minden pont egy radioatív részecske útját jelzi a fotón) az események DNS szintű ábrázolása: 34

Az E. coli DNS replikációjának első fotója (1963) Replikálódó E. coli táptalajhoz 3 H timidint adva a DNS-be beépült radioaktivitás a hibrid szálak autoradiogramján kimutatható A következő replikációs ciklus során a képződő új kettős spirál mindkét szála radioaktívan jelölt lesz 35

Cirkuláris DNS kétirányú replikációja kezdőpont A széttekeredő szálak mindkét villájában folyamatos a DNS szintézise, amíg a gyűrű megkettőződése be nem fejeződik 36

A replikációs kezdőpont (origó) A replikációnak kitüntetett kezdőpontja (origója) van az E. coli egyetlen replikációs origója, az ori. C, 245 nukleotidpár hosszú 37

A replikáció iránya, a replikációs villa 5’ 3’ Elsőként átíródott darab 2. Az új szál mindig 5’ 3’ irányban szintetizálódik A replikációs villában az egyik szál a villa irányában, a másik attól távolodó irányban íródik 3. Vezető szál (folytonos átírás) Elmaradó szál (szakaszos átírás) Szemidiszkontinuus replikáció 38

A replikáció az origótól mindkét irányban halad Autoradiográfiás (3 H-timidin pulzusjelölés) kísérletekkel kimutatták, hogy a legtöbb eukarióta és prokarióta DNS replikációja kétirányú. Az egyirányú replikációra is van példa (pl. a col. E 1 plazmid) origó villa Az origótól két irányba haladó DNS replikáció összesen négy újonnan szintetizálódó szálat jelent, két folytonos (vezető) és két elmaradó szálat 39

A DNS replikáció enzimei 40

A DNS polimerázok működése DNS Polimeráz primer (= kezdő) d. CTP d. ATP d. GTP d. TTP új szál templát (= minta DNS egyesszál) A DNS polimerázok az egyes szálú DNS templátra (minta) azt kiegészítő (komplementer) szálat szintetizálnak a rendelkezésre álló nukleotid trifoszfátokból. A szálat azonban elkezdeni nem tudják, csak hosszabbítani. A kezdéshez egy rövid kezdő (primer) szakaszra van szükségük. 41

A DNS szintézis kezdése (priming) A DNS szintézist egy rövid RNS primer szintézise előzi meg, melyet az RNS polimeráz (primáz) készít. A szintézis iránya az egyik szálon a villa felé mutat, a másik szálon a villától távolodik. PRIMÁZ RNS primer szintézis irány RNS primer 42

Az E. coli DNS replikációjában két polimeráz vesz részt A DNS polimeráz III (pol III) végzi a replikációs szintézist Ø több, mint 10 különböző alegység együttműködése Ø 5’ ->3’ polimeráz aktivitás százszor gyorsabban szintetizál, mint a DNS polimeráz I Ø beépített 3’->5’ exonukleáz aktivitás és nagy processzivitás a DNS polimeráz I (pol I vagy Kornberg enzim) elemészti az RNS primereket és befejezi az elmaradó szál szintézisét. Nem lehet a replikáció fő enzime Ø 5’ ->3’ polimeráz aktivitás új nukleotidok beépítése Ø 3’->5’ exonukleáz aktivitás a hibásan beépített nukleotid eltávolítása Ø 5’ ->3’ exonukleáz aktivitás hibajavítás és az RNS primerek eltávolítása új DNS szál templát (minta) RNS primer DNS Polimeráz III 43

A Polimeráz III enzim hibajavítása szintézis iránya 5’ 3’ kivágás iránya 3’ 5’ A pol III ε (epszilon) alegysége végzi annak ellenőrzését, hogy nem történt-e hiba a szintézis során. A hibásan beépített (rosszul párosodó) nukleotidokat azonnal kivágja. A kivágás visszalépést igényel, ezért annak iránya 3’ 5’ 44

Az elmaradó szál szintézise: régi szál elmaradó szál 1. , RNS primer vezető szál a villa mozgása A vezető szál szintézise folytonos Az elmaradó szálon: 1. , A primáz RNS templátokat szintetizál. 2. , A DNS polimeráz III DNS-t szintetizál a primer folytatásaként 3. , A DNS polimeráz I eltávolítja az előtte lévő RNS darabot és befejezi a láncot 4. , A DNS ligáz összekapcsolja a különálló DNS darabokat 2. , új DNS Okazaki fragment 3. , 4. , ligálás 45

A replikáció az Okazaki fragmentekkel és a ligázzal A ligáz működése: ligáz + ATP 46

A szintézist egyetlen pol. III dimer végzi pol III dimer vezető szál elmaradó szál Az elmaradó szál templátjának kihurkolódása lehetővé teszi, hogy a replikációs villához kapcsolódó pol III holoenzim-dimer mindkét utódszálat a villa irányában szintetizálhassa 47

A szintézis segítői: helikázok és topoizomerázok helikáz topoizomeráz A kettős hélix széttekerését a helikázok végzik a hidrogén hidak bontásával Ahogy a replikációs villában szétválnak a szülői szálak, a villa túloldalán lévő DNS szakasz pozitív irányban túltekeredik. A topoizomeráz oldja fel a feszültséget olymódon mint egy forgó-láncszem. Az egyik szálat elvágja, azt a másik szál körül „kipörgeti”, majd a vágást vissza-ligálja. 48

A topoizomerázok a kettős szálú DNS csavarodottságát befolyásolják A replikációnál működő DNS topoizomeráz neve giráz, amely negatív irányban csavarja a DNS-t. A pozitív irányban megcsavarodott DNS így kilazulhat A giráz a laza DNS-t ATP felhasználásával képes negatív irányban tovább is csavarni 49

A DNS replikáció enzimei topoizomeráz 50

A replikáció pontossága A szintézis során 104 -106 nukleotidonként történik egy hibás beépülés. Ez igen magas mutációs rátát eredményezne A polimeráz III enzim saját hibajavító rendszerrel rendelkezik, és a hibás beépülések 99%-át azonnal kijavítja, így csak 108 nukleotidonként marad egy hiba A replikáció utáni javítórendszer ennek 99%-át is kijavítja. Így adódik a végső pontosság, ami 1010 nukleotidonként egy hiba (Ez az emberi genom esetén egyetlen hibát jelent egy replikáció során) 51

Több vírus és episzóma „gördülő gyűrű” (rolling circle) módon replikálódik 1. , Az egyik szál pontszerűen bevágódik (nick) 2. , Az ép szálat templátként használva a polimeráz a törött szál 3’ végéhez új nukleotidokat épít körbe-körbe, miközben leszorítja az előtte lévő régi szálat 3. , A leszoruló egyes szál kettős szállá egészül ki 4. , A lineáris kettős szál méretre darabolódik és gyűrűkké zárul konkatemer 5’ 52

Az eukarióta kromoszóma sok replikációs origót tartalmaz Egy diploid sejt 3 H timidin beépülésének képe a szintézis fázis elején Drosophila politén kromoszóma 3 H timidin beépülésének képe a szintézis fázis elején. A radioaktív jelek replikációs origókat jelölnek. 53

Az extranukleáris genetikai állomány és öröklődés cp. DNS 120. 000 -170. 000 bp mt. DNS ~17. 000 bp 54

Az extranukleáris genom jellemzői • cirkuláris • nukleáris genomtól és sejtciklustól független replikáció • az átírást végző DNS-polimeráz a magban kódolt, DE organellumspecifikus • kópiaszám >1 (cp. DNS és mt. DNS esetében is) változó, fajonként nagy eltérések lehetnek • általában anyai uniparentális öröklődés, de léteznek kivételek 55

Az anyai öröklődés 1909 Carl Correns kísérlete csodatölcsérrel Fenotípust kizárólagosan az anyai szülő határozza meg • kloroplaszt gének öröklődésével zöld fehér zöld magyarázható • NEM azonos az anyai hatással!!! heteroplazmia (pl. csigaház tekeredésének iránya) 56

heteroplazmia 57

Telomerek Cirkuláris DNS Lineáris DNS – végreplikációs probléma 58

59

A végreplikációs probléma Minden DNS replikáció során 50 -100 bp szakasz elvész, fogy a DNS Primer: 10 -12 nt > nemcsak ennek eltávolítása miatt? 60

A kromoszómák végeit a telomerek védik, aminek fenntartását a telomeráz enzim végzi 61

A telomer sapkaként védi a kromoszómák végeit Görög: telos (vég) + meros (rész) 62

A telomerek feladata 1. A szabad DNS vég védelme a lebomlástól 2. A replikációs rövidülés megakadályozása 63

Tetrahymena thermophila (egysejtű protozoa) A Tetrahymena telomer DNS szakasza megvédi a mesterséges kromoszómákat Élesztő sejtekben. A telomer szakaszban egy rövid szekvencia ismétlődik sokszorosan. 64

Telomer emberben -TTAGGG- szekvencia ismétlődik körülbelül 2500 -szor (sejt/szövet függő) Telomer kötő fehérjék kapcsolódnak hozzá (védelem) + DNS-szál visszahurkolódik 65

Egy átlagos testi sejtben a telomer minden sejtosztódás során rövidül sejt életkor becslés Kivételek: ivarsejtek, őssejtek (és rákos sejtek!) Ha túl rövid: -telomer-kötő fehérjék nem tudnak kapcsolódni - visszahajlás (loop) nem tud kialakulni - a kromoszómák végei „ragadóssá” válnak – kromoszóma átrendeződésekhez vezet - normálisan leáll a sejtosztódás (replikatív szeneszcencia), beindul az apoptózis 66

A telomer a kor előrehaladtával rövidül Magzat tüdő Újszülött bőr (nő) Felnőtt bőr (férfi) Felnőtt bőr (nő) A donor kora és a telomer hossza közt szignifikáns az összefüggés Oxidatív stressz hatására a telomer-vesztés ötszöröse lehet a normálisnak (500 bp x 4 osztódás = 2000 bp) 67

a TELOMERÁZ enzim fenntartja a telomerek hosszúságát ribonukleo-protein (saját RNS templátról DNS-t szintetizál) 1. Katalítikus alegység (h. TERT – human telomeráz reverz transzkriptáz) - transzkripcionálisan represszált a testi sejtekben (lsd. kivételek) 2. RNS alegység (h. TERC human telomeráz RNS komponens) - templátja a telomer ismétlések szintézisének - fajok közti erős konzerváltság a másodlagos szerkezetben A Tetrahymena telomer szintézis modell 68

A telomer szintézisét a TELOMERÁZ enzim végzi 69

A rákos sejtek korlátlan számú osztódásra képesek Egy normális sejt 60 -70 osztódásra képes A kromoszóma végéről egy szakasz minden osztódás során elvész A genetikailag nem stabil sejt normális esetben elpusztul A rákos sejtek nem pusztulnak el, tovább osztódnak és még több hibát halmoznak fel, képesek “halhatatlanná” tenni magukat pl. a He. La sejtvonal (Henrietta Lacks, 1951 -ben izolálták) Ezt a telomeráz enzim reaktivációjával magyarázzák 70

A rákos sejtekben a telomeráz enzim re-aktiválódik ALT- alternative leghtening of telomeres a daganatok kis hányadában NINCS megemelkedett telomeráz aktivitás – más mechanizmus is (? ) még tisztázatlan 71

A telomereknek fontos szerepük van a rák, az öregedés és néhány örökletes betegség kialakulásában Werner szindróma - Autoszomális recesszív - WRN génben mutáció (helikáz) - fokozott telomer vesztés 72

Daganatterápia telomeráz-gátlással? szelektív, mert a normális szövetekben telomeráz-aktivitás alig van de! hatásuk az őssejtekre (? ) ALT-mechanizmus „áttérve” erre a daganatsejtek rezisztensekké válhatnak 73

74