A DNS CHIPEK S ALKALMAZSUK SZE Bioinformatika 2003

A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003. 10. 09. MTA SZBK DNS-Chip Laboratórium www. szbk. hu/chiplab~ DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Kromoszómák genetikai állomány hordozói sejt DNS Gének információ hordozók m. RNS AAAAAA Fehérjék sejtfunkciók ellátása AAAAAA

Néhány definíció „Genom, avagy a DNS birodalma”: egy szervezet teljes DNS készlete. „Transzkriptom, avagy a hírvivő RNS-ek birodalma”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő m. RNS készlet. „Proteom, avagy a fehérje birodalom”: egy sejten belüli, egy időpontban jelenlévő fehérje készlet. c. DNS=copy DNS, az érett m. RNS DNS-sé átírt változata Oligonukleotid=néhány tíz nukleotidból álló DNS darab DNA-chip Lab. BRC, Szeged

A genomprogram • Humán Genom Projekt és a Celera Genomics nevű biotechnológiai óriás 2000 -ben együttesen jelentették be az emberi genetikai állomány kódjának közel teljes megfejtését. • 2001 februárjának közepén hozta nyilvánosságra eddigi eredményeit a világ két legrangosabb tudományos folyóiratában, a Nature, illetve a Science lapjain. „Az emberiség 100, 000 éves történelmének egyik legfontosabb napja, hiszen az emberek először olvashatják el saját könyvük betűit” Craig Venter, a Celera igazgatója DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Néhány érdekes adat az emberi genomról • Trillió sejt/szervezet • 3 milliárd betű/sejt • 2 méternyi DNS/sejt • 1 betű/mp, 24 óra/nap 100év. • 1 betű-mp, 16, 5 perc egy különbség. • 12 000 nukleotidot határoztak meg minden mp-ben Human Genome Project keretén belül • 3 mm-es távolságban összerakva 9000 km lenne, több mint 2 x hosszabb mint a Mississippi • a korábbi feltételezésekkel (80100 ezer gén) ellentétben csak kb. 35 ezer gén • a genomnak csak 1 -1, 5%-a kódoló, azaz exon szekvencia • egyenlőtlen géneloszlás-genetikai sivatagok • egyenlőtlen a kromoszómális eloszlás is (az XY kromoszómák sokkal kevesebb gén tartalmaznak mint pl. a 17 vagy 22 -es kromoszóma • kb. 3 millio SNP minden 1000 „beteg” • a rasszok jobban hasonlítanak egymásra a két nem DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések A funkcionális molekuláris biológia lényege 1. szövet, szerv szint T G daganat képződés, gyulladás, különböző betegségek P Minőségi és mennyiségi változások funkciók felderítése G T P sejt szint sejtosztódás, diffrenciáció, sejthalál

A funkcionális molekuláris biológia és diagnosztika lényege (2) Eltérő állapotok molekuláris hátterének felderítése Trombosis, sclerosis DNS RNS fehérje metabolitok vizsgálata Összehasonlítás egészséges szövettel DNA-chip Lab. BRC, Szeged Segítség: adatbankok, szekvenálási projektek

P P P P aktív gének vizsgálata T AAAAA G T AAAAA G Minőségi és mennyiségi változások követése Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések A funkcionális molekuláris biológia lényege 3.

Az 1990 -es években egy forradalmian új technika, fejlődött ki a gén és fehérje funkciók analízisére. Chip-technológia A biochipek nagyszámú (több ezer) c. DNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek A biochipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak DNA-chip Lab. BRC, Szeged

A DNS-chip technolólgia komplementer nukleinsav-láncok hibridizációján alapul

Comparative molecular expression analysis A. Examination of “transcriptome” (generation of m. RNA maps) 1. Hybridization-based techniques - Northern blotting - RNase protection/S 1 -mapping - Subtraction cloning - DNA arrays B. Examination of “proteome” (generation of protein maps) - 2 D gelelectrophoresis - MALDI-TOF mass spectrometry - combined electrophoretic and microsequencing techniques - “protein-chip” techniques 2. PCR-based techniques - Differential display - RDA (representational difference analysis) 3. Sequence-based techniques - ESTs (expressed sequence tags) - SAGE (serial analysis of gene expression) - DNA sequencing chip - Mass spectrometry sequencing DNA-chip Laboratory, BRC. Szeged

Dot-blot technika Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve Radioaktív génspecifikus próba A pozitív RNS minták jelölődnek Hibridizáció Teljes RNS jelölése Reverz dot-blot technika Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz DNS-chip technika DNA-chip Lab. BRC, Szeged Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek Hibridizálás 100 -20, 000 Génspecifikus minta

A chipek hordozó szerinti osztályozása macroarray microarray chip • nylon membránon néhány 100 génspecifikus minta (DNS darab) • radioaktív jelölés • kis minta sűrűség (100 -1000 pont/cm 2) • üveglemezen több 1. 000 -10. 000 génspecifikus minta (DNS darab) • fluoreszcens jelölés • közepes mintasűrűség (5000 pont/cm 2) • üveglemezen több 10. 000 -100. 000 génspecifikus minta (DNS darab) • fluoreszcens jelölés • nagy minta sűrűség (10. 000 pont/cm 2)

Egy chipkísérlet lépései c. DNS klón és/vagy DNS szekvencia biológiai minta szövetből, sejtkultúrából nyomtatás Makroarray Mikroarray Chip m. RNS, DNS, fehérje Hibridizálás, fehérje-ellenanyag kölcsönhatás jelölt minta néhány 100, vagy több 1. 000, 10. 000 gén, fehérje X adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó információk értékelése

c. DNS alapú chip készítése Egyedi baktérium klónok izolálása kék/fehér szelekció CHIPKÉSZÍTÉS c. DNS könyvtár baktériumban Ismert és ismeretlen szekvenciájú c. DNS darabokat tartalmazó klónok Tisztítás PCR amplifikáció 96 mintahelyes lemezeken PCR reakció ellenőrzése felcsepegtetés üveglemezekre Minden lemezen több 1000 ismert és ismeretlen szekvenciájú c. DNS darab szerepel duplikátumban DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Microgrid Arrayer. Bio. Robotics, UK DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Microgrid Arrayer Bio. Robotics, UK • 4, 16 tű • 84 lemez • 24 mikrotiter lemez (384) • Sebesség: 6400 pont < 4 h. • Sűrűség: 20. 000 pont/lemez DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Nyomtatótű a Micro. Arrayer robothoz DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Making microarrays by mechanical microspotting and ink jetting 1. Mechanical microspotting Touch surface Sample is loaded into a spotting pin by capillary action Move pins Small volume is transferred to a solid surface by physical contact between the pin and the solid surface Wash, repeat Same sample can be transferred with the same pin to the next solid surface generating multiple arrays Microarray After the first spotting cycle, the pin is washed and the next sample is loaded and deposited 2. Ink jetting Deliver drop Sample is loaded into a miniature nozzle equipped with a piezoelectric fitting Move jets Wash, repeat An electrical current is Second sample is loaded used to expel a precise and deposited to an adjacent amount of liquid from the address jet onto the surface Microarray DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Oligonukleotid alapú chip készítése 1. szintetikus oligonukleotidok kémiai kikötése

Oligonukleotid alapú chip készítése 2. in situ szintézis CHIPKÉSZÍTÉS Affymetrix DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Semi conductor Microarrays 1. Semiconductor Base 2. Scalable Density 3. Active Device - Computer Controlled Electro-Chemistry • Multiplex in situ custom DNA synthesis • 1 k and 10 k features available

In situ Micro. Array DNA Synthesis 5 1 60 Cycles 2 4 3

Scalable Technology Platform 1024 Features 1 K 13, 416 Features 10 K

Nagyobb DNS molekulák pl. PCR- felskszorozott c. DNS klónok kovalens kikötése aktivált tárgylemezre DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Mire alkalmasak a chipek? G Genom Mutációk, Egy nukleotid eltérések (SNP), deléció, inszerció AAAAA DNS-chipek m. RNS T Transzkriptom Gén kifejeződés megváltozása Fehérjék P Proteom Kifejeződés, módosítások, kölcsönhatások Fehérje-chipek DNA-chip Lab. BRC, Szeged AAAAA

Pontmutációk (SNP) detektálása hibridizáció mosás DNS 2. SNP 2 pozíció Jelölt DNS 1. SNP 3 pozíció • Oligonukleotid alapú chipek • egy nukleotid eltérés azonosítása A G T C detektálás Adat analízis 1. SNP: 3. pozíció A-C 2. SNP: 2. pozíció C-T DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Génkifejeződés tanulmányozása – c. DNS vagy oligonukleotid chip – transzkriptom analízise – aktív-inaktív gének detektálása – bonyolult adat és statisztikai analízis aktív gének vizsgálata Jelölt c. DNS hibridizáció AAAAA mosás AAAAA m. RNS biológiai anyag DNA-chip Lab. BRC, Szeged detektálás Adat analízis: • relatív aktivitás mérése • a színessel jelölt gének aktívak • a feketék nem

Jelölt próba készítése: két különböző minta együttes analízise kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet RNS tisztítás Cy 5 d. CTP jelölt c. DNS DNA-chip Lab. BRC, c. DNS írás RNS-ből (reverz transzkripció) Hibridizáció, mosás Szkennelés Cy 3 d. CTP jelölt c. DNS

c. DNS-chipek alkalmazásai: (1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata RNS c. DNS-chip 4000 különböző Arabidopsis génmintát tartalmaz DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata Mycobacterium tuberculosis-ban c. DNS-chip technikával 1. c. DNS-chip készítése 2. RNS izolálás, és próbakészítés M. tuberculosis-ból Kezeletlen, kontroll baktériumok 3, 834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a) PCR génspecifikus primerekkel, tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevont mikroszkóplemezekre robot segítségével 4. Adatfeldolgozás Isoniaziddal kezelt baktériumok RNS izoláció, jelölt c. DNS készítése Cy 3 -d. UTP és Cy 5 -d. UTP felhasználásával Reverz transzkripció reakcióban. 3. Hibridizáció EREDMÉNYEK: - Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak: II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt. - további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus hatásával magyarázható általános hatás miatt - egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték PNAS (1999) 96, 12833 -12838 Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel.

c. DNS-chipek alkalmazásai: (2) eltérő állapotokért felelős génexpresszió különbségek vizsgálata RNS c. DNS-chip 6000 különböző egyedi egér génmintát tartalmaz Új gének azonosítása Génfunkciók jellemzése Génkölcsönhatások megértése Differenciáció tanulmányozása Tumorképződés vizsgálata Gyógyszerek felfedezése DNA-chip Lab. BRC, Szeged

Egészséges és dagantos (HBL 100 vs. breast carcinoma BT 474) szövetek génkifejeződéseinek összehasonlítása DNA-chip Lab. BRC, Szeged

-16 02 q 13 06 q 27 Xp 11. 3 -p 11. 23 22 q 13. 1 21 q 22. 1 20 q 13. 33 20 q 11. 22 19 q 13. 43 19 q 13. 4 19 q 13. 12 19 p 13. 2 18 q 21. 3 18 p 11. 1 -q 11. 2 17 p 13 16 q 23. 1 14 q 24 -q 31 13 q 32. 2 12 q 12 p 13 11 q 23 10 p 11. 2 09 q 32 -q 33. 3 09 q 21. 2 09 p 13 09 p 12 -13. 3 08 q 21. 2 -q 21. 3 08 p 23 07 p 21. 3 9 07 p 15. 3 -7 p 14 Tüdő génarány 06 p 21. 31 06 p 21. 3 04 p 16. 3 03 q 21. 1 -q 21. 2 03 q 03 p 21. 3 03 p 21. 1 -9 02 q 34 -q 35 normál 02 p 13 -p 12 01 q 31 -q 32 01 q 24 -q 25 -11 01 q 21. 3 01 q 21. 2 -22 01 q 21. 1 01 q 21 01 p 36. 31 01 p 34. 2 01 p 33 -34. 2 01 p 13 -p 21 01 p 12 -13. 3 Genomszintű változások, kromoszóma rendellenességek, amplifikációk, deléciók detektálása Paraffinba ágyazott minták daganat DNS PCR Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása Génátrendeződési arányok 4 -1 -6 agy génarány

Lézer szkenner Cy 5 beteg, gyógyszerrel kezelt, különböző környezeti hatásoknak kitett sejt vagy szövet Cy 5 d. CTP jelölt c. DNS Képanalízis Lézer szkenner Cy 3 kontroll minta (egészséges, kezeletlen) sejt vagy szövet Cy 3 d. CTP jelölt c. DNS

? Nem szignifikáns adatok ADATFELDOLGOZÁS „Árnyékzóna”

Cy-3, Cy-5 jelek kvantitatív összehasonlítása Quantarray szoftverrel (GSI Lumonics) Arány és intenzitás megszorítások nélkül Arány és intenzitás megszorításokkal DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

DNS-chipek képanalízise

Adatfeldolgozás, statisztikai analízis R 1=(CH 1 I-CH 1 Bk)/(CH 2 I-CH 2 Bk) R 1 M=IF(CHB 1<0. 55, "", IF(CHB 2<0. 55, "", IF(FLAG=1, "", R 1))) R 1 MN=IF(R 1 M="", R 1 M/No. F) R 1 MNA=IF(R 1 MN="", IF(R 1 MNx="", IF(RMN 1 Rep>=RMN 1 x, IF(RMN 1 Rep/RMN 1 x<2, (RMN 1 x+RMN 1 x)/2, ""), IF(RMN 1 x/RMN 1 Rep<2, (RMN 1 Rep+RMN 1 x)/2, ""))))

Slide 42

Ratio Cy 5/Cy 3 Ábrázolási módszerek 1. normál arány Spot label

Ábrázolási módszerek 2. log 2 arány

Leukémiák molekuláris osztályozása génexpresszió monitorozással DNS-chipek alkalmazásával - Új alosztályok felfedezése - Új esetek osztályozása - Jóslat kemoterápiás kezelés hatékonyságára - Atipikus esetek tisztázása Jövő: Science 1999, 286, 531. - Tumorminták gyűjtése - Kemoterápia jellemzése - Expressziós analízis - Adatbank létrehozása - Alosztályok meghatározása - Kemoterápiára adott válaszok jellemzése DNS-chipekkel - hatásmechanizmus feltárása - rezisztenciáért felelős gének azonosítása

B-sejt limfómák osztályozása Alizadeh et al. , Nature, 2000, 403, 503 -511.

Mintaelőkészítés, csoportosítások terve krónikus mieloid leukémiák osztályozásához Teszt és általános gének azonosítása: 1. típus diagnózis kezelés RNS kontrol 2. típus 3. típus CML 1. beteg 2. beteg x. beteg kontrol RNS RNS c. DNS korai reakció RNS kontrol RNS RNS RNS kontrol kontrol hibridizálás Későbbi kimenetel tünetmentesség relapszus RNS kontrol

Génexpressziós klaszterek patkány fejlődése során The time of birth is marked by a vertical line a. Normalized gene-expression trajectories are shown grouped by waves that are determined by clustering. The graphs below show the average normalized expression pattern or wave over the nine time points for all of the genes in each cluster. b. Tree of all gene-expression pattern. c. Plots of all normalized time series, highlighted wave 3.

Dataprocessing and visualization Sejtosztódást gátló, apoptózist serkentő vegyület hatásának vizsgálata 3 sejttenyészeten 2 különböző koncentrációban humán c. DNS-chippel Repression of cell division Imaging: „tree” & „galaxis” clastering methods