TOKSKOLOJK TESTLER nvivo ve nvitro Modeller ZEHRLENME VE

TOKSİKOLOJİK TESTLER İnvivo ve İnvitro Modeller (ZEHİRLENME VE ZEHİRLİLİK DENEMELERİ) Doç. Dr. Dilek GÜVENÇ

Toksikolojik Testlere Neden İhtiyaç Var ? ? ? İnsan ve veteriner ilaç endüstrisinde ve zirai alanda çok sayıda yeni kimyasal var. • İlaç geliştirmenin başarılı olması için güvenlik taraması (safety screening) yapılması gerekli • Bu nedenle özellikle deney hayvanları toksisite testlerinde • Yeni geliştirilen bir ilâcın etkinliğinin araştırılmasında, • İlacın spesifik bir hastalıkta kullanım etkinliğinin (hastalık modeli oluşturarak) saptanması •

Toksikolojik Testlere Neden İhtiyaç Var ? ? • Hastada (insan, pet hayvanı ve çiftlik hayvanı) güvenli kullanım derecesinin ortaya konulması • Veteriner ilaçlarının besin değeri olan hayvanlarda güvenliğinin değerlendirilmesi • Hayvansal kökenli besinlerde bulunan veteriner ilaç kalıntılarının seviyesi (NOEL) ve sonuç olarak insan diyetinde kabul edilebilir günlük alım miktarını (ADI) belirlemek.

Veteriner Hekimlerin Rolü nedir? ? • Toksikolojik test laboratuvarları artık ilgili mevzuatla desteklenebilecek hayvanların kullanımıyla ilgili resmi kontrollere ve denetimlere uymak zorundadır. • Ülkemiz de dahil olmak üzere çoğu Avrupa ülkesinde, veteriner hekimler toksisite testlerinde çok önemli bir rol oynamaktadır • Daha spesifik olarak, Veteriner Hekimler uygun in vivo modellerin seçimi konusunda tavsiyelerde bulunmak ve yerel etik inceleme sürecinde alternatif yöntemlerin kullanılmasına öncelik verilmesini sağlamakla yükümlü Üniversitemiz bünyesinde de DEHAM (Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi)

D E H A M

Peki Bu testler İlaçların % 100 Güvenli Olduğunu Gösterir mi? ? ? • Bu testlerle güvensiz oldukları kanıtlandıktan sonra bazı kimyasalların yasaklanmasına yol açan verileri üretebilir. ANCAK!!!! • Tüm klinik öncesi ve klinik testlere rağmen ilâçların kullanım emniyeti tam olarak belirlenememektedir.

Peki Bu testler İlaçların % 100 Güvenli Olduğunu Gösterir mi? ? ? • Örnekler; İzoprenalin astımda inhaler şeklinde kullanılan bir ilâç , 3500 kişinin kalp yetmezliğinden ölümüne neden olmuştur. • Benoxaprofen artritte kullanılan bir ilâç olup, İngiltere'de karaciğer harabiyetine bağlı 61 ölüme sebep olması sonucu yasaklanmıştır • Bir kalp ilâcı olan practolol, aynı ülkede körlük dahil görme problemlerine ve 23 kişinin ölümüne neden olmuş • Zayıflama ilâcı olan dexfenfluramine ve fenfluramine'in ciddi pulmoner hipertansiyon ve kalp rahatsızlığı ile ölüme neden olmuştur. n Şahan SAYGI: Deneysel toksikolojide toksisite testleri Ve test sonuçlarının önemi Gülhane Tıp Dergisi 45 (3) : 291 - 298 (2003)

Toksisite Testleri Kimyasal maddelerin canlı organizmalar üzerindeki zararlı etkileri n Toksik etkilerinin görülmeyeceği doz değerlerini saptamak için yapılır. n Maddelerin sağlam hayvanlarda farmakolojik ve toksikolojik etkilerinin incelenmesini kapsar n

Toksisite Testleri n Beklenen toksik etkinin görülmesine yönelik testlerde, bu etkiyi oluşturduğu bilinen bir kimyasal maddenin, pozitif kontrol grubuna uygulanması ve deneyin sağlıklı işlediğinin test edilmesi gerekir

Toksisite Testleri n Herhangi bir madde veya metaboliti ile canlıların belli bir süre veya sınırsız temas etmesi sonucu gelişen görevsel, yapısal, biyokimyasal vb. istenmeyen etkilerin nitel ve nicel olarak değerlendirilmesi esasına dayanır

İnvivo Toksisite Testleri Toksikolojik testlerde en sık kullanılan hayvanlar kemirgenler ve tavşanlardır. n Kediler ve köpekler toksisite testlerinde (ve çoğunlukla preklinik toksikoloji veya faz I farmakolojik çalışmalarında) daha az kullanılırlar n İnsan olmayan primatlar nadiren ve çoğunlukla toksik bileşiklerin metabolizmasını incelemek için kullanılır n

İnvivo Toksisite Testleri n Toksisite testlerinde genellikle insanlara anatomik ve fizyolojik yakınlığı olan sıçan (rat) ve köpek kullanılır

İnvivo Toksisite Testleri n n n Deneme hayvanlarında görülen etkilerin, diğer hayvanlarda ve insanlarda da görüleceği kabul edilir Ancak özellikle sitokrom p 450 aktivitesi küçük deneme hayvanlarında daha hızlı olduğundan etkilerin birebir aynı olması mümkün değildir ve çeşitli güven faktörleri kullanılmak zorundadır Zehirliliğin değerlendirilmesinde en önemli faktör doz-yoğunluk-etki ilişkisi

İnvivo Toksisite Testleri Test Materyalini Uygulama yolu n Maruziyete göre seçilir.

İnvivo Toksisite Testleri Test Materyalini Uygulama yolu Oral uygulama (yemle, suyla veya gavaj) n İnhalasyon (burun, kafa veya tüm vücut ) n Dermal (deri içine enj. , deri veya kulaklara topikal uygulama) n Tamamen emilime ihtiyaç duyulursa parenteral uygulama yolları (intraperitoneal, intramüsküler, intravenöz ve subkutan) seçilir. n

Toksisite Testleri Tek doz denemeleri n Tekrarlanan doz denemeleri n n Maddenin kullanılma ve maruziyet süresine göre deneme şekli seçilir

Toksisite Testleri n Tek doz (akut zehirlilik) denemeleri ¨ LD 50 (ÖD 50) tespiti (24 saat) ¨ Lokal ve parenteral akut zehirlilik denemeleri (14 gün) n Tekrarlanan doz denemeleri ¨ Subakut (28 gün) ¨ Subkronik (13 hafta-90 gün) ¨ Kronik (6 ay-2 yıl) ¨ Özel zehirlilik denemeleri n n n Karsinojenite Mutajenite Teratojenite Diğer maddelerle etkileşme Üreme sistemine etkiler

Akut Toksisite Testleri n n n n Yeni ürünler için ilk yapılan deneme LD 50 genelde oral, deri ve solunum yoluyla belirlenir En az 10 hayvanlık gruba en az 3 farklı dozda madde uygulanır 24 saat içinde ölen hayvanların yüzdesi belirlenerek kuvantal-doz-etki ilişkisinden LD 50 hesaplanır İncelemeler 7 -14 güne uzatılabilir Maddeler LD 50 değerlerine göre sınıflandırılır LD değeri verilirken kullanılan deney hayvanı ve maruziyet yolunun da belirtilmesi gerekir.

Akut Toksisite Testleri Ağız (Oral) n Deri (Dermal)-Tavşan n Solunum (İnhalasyon) n Su ile maruziyet-Balık n Deri ve mukozalar için irkiltici etki n Göz için irkiltici etki n Deride aşırı duyarlılık denemesi-Kobay n

Akut Toksisite Testleri Akut toksisiteye dair (LD 50) kantitatif bir tahmin sağlar. n Hedef organları ve akut toksisitenin diğer klinik belirtilerini tanımlar. n Tür farklılıklarını ve duyarlı türleri tanımlar. n Toksik cevabın geri dönüşü olup olmadığını ortaya koyar. n Diğer çalışmalarda doz aralığı yönlendirmesi sağlar. n

Tekrarlanan doz denemeleri n Amaç, hayvanların incelenen madde veya madde karışımlarına belirli süre devamlı maruz bırakılması sonucu, oluşabilecek fizyolojik veya patolojik etkilerin nitel ve nicel olarak değerlendirilerek maddenin etkisiz miktarını belirlemek

Subakut Toksisite Testleri 28 gün (14 -30 gün) sürer n Sıçanlarda her iki cinsiyetten en az 10 hayvandan oluşan en az 3 doz grubu; köpeklerde 3 -4 hayvan n Uygulama yolu olarak o maddenin günlük hayatta muhtemel kullanım yolu seçilir n

Subakut Toksisite Testleri Klinik, hematolojik, biyokimyasal, patolojik değişiklikler incelenir n Bu test ile toksisitede hedef organlar saptanabilmekte, subkronik ve kronik toksisite testleri için ön veriler oluşturulmaktadır. n

Subkronik Toksisite Testleri 90 gün sürer (1 -3 ay) n Sıçanlarda her iki cinsiyetten en az 10 hayvandan oluşan en az 3 doz grubu; köpeklerde 3 -4 hayvan n Genellikle oral yol n Klinik, hematolojik, biyokimyasal, patolojik değişiklikler incelenir n

Subakut ve subkronik toksisite testlerinde n doz cevap ilişkisinden yararlanılarak gözlemlenen en düşük etki düzeyi (LOEL) veya n en düşük advers etki düzeyi (LOAEL), n hiçbir advers etkinin gözlenmediği en yüksek düzey (NOEL veya NOAEL) hesaplanabilir n

Kronik Toksisite Testleri 6 ay-2 yıl sürer n Doz seçimi çok önemli n Amaç, incelenen maddenin uzun süreçteki etkilerini belirlemek kimyasal maddenin insanlar tarafından ömür boyunca kullanması bekleniyorsa, deneysel kronik toksisite testinin süresi deneyde kullanılan hayvanın tüm ömrünce, örneğin, bu süre sıçanlarda yaklaşık iki yıl, köpekte ise beş ile yedi yıl kadar olabilir n

Gelişme ve üreme üzere etki denemeleri Çiftleşmeden önce ve gebelikten itibaren madde uygulanır, teratojenite dahil üreme ve gelişme üzerine etkiler incelenir n Doğum öncesi maruziyetin gelişmekte olan fetus üzerindeki potansiyel etkileri ile ilgili tehlikeyi belirlenir. n Zigottan yenidoğana gelişim boyunca fonksiyonel ve yapısal değişiklikler n

Karsinojenite testleri Sıçan (24 -30 ay) ve farelerde (18 -24 ay) ömür boyu yapılır n F 344 rats and B 6 C 3 F 1 mice kullanılır n Her iki cinsiyette. üç farklı doz, beş farklı uygulama yolu n Genelde 30 -60 hayvan kullanılır n

Genotoksisite Testleri n Genotoksisite testinin amacı, gen hasarını tespit etmektir. Kromozom aberasyonları ve kırılmaları, nokta mutasyonu ve diğer DNA ve kromozomal etkiler belirlenir.

Diğer Özel Toksisite Testleri Bu testler dışında özel toksisite test teknikleri de vardır. n Bunlar amaçlarına göre; teratojenite, mutajenite testi, akut dermal ve göz irritasyon testleri, deri duyarlılık, nörotoksisite n

İnvitro Toksisite Testleri Hayvan deneylerinde n Etik n Ekonomik n Fazla iş gücü gerektirmesi n Tekrarlanabilirliği sağlamanın zor olması n Zaman sorunu gibi nedenlerle günümüzde hayvan deneylerine alternatif olarak invitro testler (hücre ve doku kültürü) giderek yaygınlaşmaktadır.

İn vitro Toksisite Testleri İn vitro hücresel modeller, hayvan modellerine kıyasla nispeten ucuz ve bakımı ve manipüle edilmesi kolaydır. n İn vitro yöntemler ile, incelenecek maddenin spesifik bir hücre veya doku tipleri üzerindeki doğrudan hücresel etkilerinin kontrollü bir ortamda incelenmesini sağlar n

İn vitro Toksisite Testleri Ancak bu sistemler in vivo ile karşılaştırılınca ortamda n büyüme faktörleri n Enzim sistemleri n Eliminasyon ve n Metabolizma n Hücre hücre etkileşimleri eksiktir n Yaşam siklusları kısadır n

İn vitro Toksisite Testleri n Amerika Ulusal Kanser Enstitüsü kanser araştırmalarında fare kullanımından vazgeçerek, 60 çeşit insan kanser hücre kültürü üzerinde bağırsak, akciğer, melanoma, böbrek, beyin ve kanseri için haftada 300 yeni kimyasal maddenin antikanser etkinliğini araştırabilmekte, hücre kültürlerinden alınan sonuçların daha gerçekçi ve daha spesifik olduğu ifade edilmektedir

İn vitro Toksisite Testleri Hücre Kültürü Sistemleri Steril özel ortamlar gerektirir. n Bileşimi hücreden hücreye farklılık gösterebilen mediumlarda çoğaltılırlar. n Primer hücre hatları n Devamlı hücre hatları (Hep. G 2, He. LA, SH 5 SY) gibi çeşitleri var n

Sonuçların değerlendirilmesi Nitel (klinik gözlem) n Nicel (İstatistiksel) n

Sonuçların insanlara uygulanması Öngörüsel toksikoloji n Risk değerlendirmesi n

Sonuçların insanlara uygulanması Deney hayvanlarının ömürlerinin genellikle kısa olması n Vücut yüzeyi hacim oranının insan ve büyük hayvanlardan daha büyük olması n Enzim etkinliğinin fazla olması n nedeniyle sonuçların insanlara uyarlanması zor ve güven faktörü gerekli

Güven faktörü İnsanlar hayvanlara göre 10 kat daha duyarlı n İnsanlar arasında da 10 kat fark olabilir n Bu nedenle 100 güven faktörü kabul edilir n Yani deneme hayvanlarında güvenli kabul edilen dozun 1/100’ü insanlarda güvenli kabul edilir n

Etkisiz düzey veya miktar NOEL (No Observed Effect Level): Herhangi bir etki görülmeyen madde miktarı n NOAEL (No Observed Adverse Effect Level): Herhangi bir istenmeyen etki görülmeyen madde miktarı n

Kabul edilebilir günlük alım (KGA; ADI) Besinlerde kalıntı halinde bulunan ilaç vb kimyasal maddelerin ömür boyunca alındığında bile sağlık açısından hiçbir etkisi olmaksızın günlük olarak alınabilecek en yüksek miktar (mg/kg/vücut ağırlığı/gün) n Mikrobiyolojik KGA: Antibiyotikler için KGA n

Tolerans düzeyi (güvenli miktar) n İlaç vb maddelerin insan ve hayvanlar tarafından tüketilene kadar besin, yem ve yem hammaddelerinde bulunmasına izin verilen en yüksek kalıntı miktarı ¨ Sınırlı tolerans ¨ İhmal edilebilir tolerans ¨ Geçici tolerans ¨ Sıfır tolerans

Sınırlı tolerans İlaç vb. maddelerin besin ve yemlerde bulunmasına izin verilen ölçülebilir kalıntı miktarı n Kronik yedirme denemeleri ile belirlenir n

İhmal edilebilir tolerans Zehirlilik açısından önem taşımayan, en duyarlı analiz yöntemleri ile belirlenen en küçük kalıntı miktarı n Subkronik denemelerle tespit edilir n

Sıfır tolerans n Çok zehirli ve karsinojen maddelerin yem ve besinlerde bulunmaması

Geçici tolerans Yetkili otoritelerin bütün testler tamamlana kadar eldeki verilerle belirlediği en yüksek kalıntı miktarı n Yeni bilgilere göre değiştirilebilir n

Bekletme süresi n İstenmeyen etkileri olan maddelerin, hayvanlara uygulandıktan sonra ürünlerin tüketilmemesi için geçmesi gereken süre(kalıntı miktarının tolerans düzeylerine inmesi için gerekli süre)

Bekletme süresi Kesim öncesi bekletme süresi (İ. K. A. S. ) n Süt veya yumurtanın tüketilmeme süresi n Bal hasadının yapılmama süresi n Su ürünlerinin avlanmama süresi n

İlaç kalıntısı ve belirlenmesi n n Hayvanlara uygulanan maddelerin ve metabolitlerinin vücut sıvı ve dokularında incelenmesi Örnek hazırlama ve analiz aşamaları gerekir İleri analiz teknikleri (GC, HPLC, MS vb) gereklidir ppt düzeyinde madde tespit edilebilir