Diagnstico das Leucemias na Infncia Dra Maria Lcia

Diagnóstico das Leucemias na Infância Dra. Maria Lúcia de Martino Lee Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM

Desenvolvimento das Técnicas de Coloração • EHRLICH - 1877 NEUTRÓFILOS BASÓFILOS ACIDÓFILOS ( Eo) Descrição morfológica das leucemias

SÉCULO XX AVANÇOS TECNOLÓGICOS Reconhecimento da heterogenecidade das leucemias Técnicas convencionais: morfologia e citoquímica Imunofenótipo Citogenética convencional Genética molecular. Expressão genética/proteica.

SECULO XXI • Reconhecimento subgrupos biologicamente homogeneos • Identificação fatores prognósticos • Delineamento de tratamentos mais específicos

Diagnóstico e Classificação • Diagnóstico + classificação precisos = Essenciais para o estudo biológico e o sucesso terapêutico das leucemias infantis; • Sistema de classificação ideal deve ser biologicamente relevante; • Deve ser útil tanto ao onco-hematologista clínico, quanto ao pesquisador; • Deve ser reproduzível e amplamente utilizável.

Diagnóstico das Leucemias Sangue Periférico Mielograma Morfológico FAB Citoquímica Imunofenotipagem POX/SB Linhagem PAS Sub-linhagem Esterases Citogenética/ Genética Molecular Alterações: - estruturais - numéricas

Diagnóstico das Leucemias Avaliação morfológica Aplasia Medular Infiltração MO Tu Leucemias SMD PTI SHF Calazar Anemia Meg S. Chediak Higashi HIV

Diagnóstico das Leucemias Avaliação morfológica • Aspiração seca: a avaliação será enfocada apenas no SP e no estudo histológico da BIÓPSIA de MO. • Cerca de 20 % dos pacientes com leucemia não apresentam blastos circulantes ao diagnóstico.

Diagnóstico e Classificação das Leucemias AGUDAS • Representam 95 % das leucemias infantis • Proliferação de células imaturas: BLASTOS. • Sua enumeração na MO é fundamental para a definição diagnóstica de leucemia aguda. CRÔNICAS • Representam 3 a 5 % casos das leucemias infantis. • Proliferação de células relativamente bem diferenciadas.

Avaliação Morfológica/Citoquímica • Introduzidas na década de 60, algumas colorações citoquímicas (MPO, SBB, NSE) auxiliam na definição da linhagem e no diagnóstico de alguns subtipos de LMA.

Mieloperoxidase (MPO) • Cora os grânulos primários dos precurssores granulocíticos e menos intensivamente dos monócitos. • Ainda é considerada a reação “gold standard” para a diferenciação morfológica entre blastos linfóides (negativos) e mielóides (positivos).

MPO

Negro de Sudan (SBB) • Coloração não enzimática dos fosfolipídeos das membranas dos grânulos. Interpretação de positividade paralela a MPO, porém mais intensa.

Esterases não Específicas (NSE): Esterases não específicas (NSE): • alfa naftil acetato ( ANA ) esterase • alfa naftil butirato (ANB) esterase • Cruciais para a determinação de monoblastos/monócitos. É descrita em escala de 0 a + 4, e somente em níveis +3 ou +4 é caracterizado o blasto como monocítico. • Monócitos maduros reagem menos intensamente que monoblastos.

ANB esterase

• Demais (PAS, Esterase Específica - CAE), Fosfatase Ácida, Ferro Medular): são atualmente de limitado valor diagnóstico. PAS

Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica Linfóides: – Representam 80 % das leucemias infantis. – Caracterizam -se pela presença na MO de >25 % de blastos de características linfóides. MIelóides: – Representam 20% das leucemias infantis. – Blastos constituem no mínimo 30% do total das cels nucleadas ou não eritróides da MO ou mais de 20% de acordo OMS.

Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica Classificação FAB (1976): • Primeira a unificar a classificação das leucemias • Permitiu a comparação entre diferentes protocolos terapêuticos • Atualmente, ainda é a base citomorfológica para a classificação das LMA e SMD.

Diagnóstico e Classificação Morfológica / Citoquímica FAB LLA LMA SMD (L 1, L 2, L 3) (M 1 – M 6) 1985 (M 7) (RA, RARS, AREBt, LMMC)

Outras classificações Classificação MIC (1986): • Classificação das LLA e posteriormente das LMA. • Baseia-se em critérios morfológicos, imunológicos e citogenéticos. Classificação da OMS (2001): • Inclui achados morfológicos/citoquímicos, além de características imunofenotípicas, genéticas e clínicas específicas.

Classificação Morfológica FAB LLA L 1 L 2 L 3

Classificação Morfológica FAB LLA

Classificação Morfológica FAB - LMA M 4 Eo a/b M 3 v

LMA - M 0

LMA – M 1

LMA – M 2

LMA - M 2

LMA - M 3 v

LMA – M 4 Eo

LMA – M 5

LMA – M 6

LMA – M 7

Proporção aproximada de casos LMA na infância por subtipos 2 4 2 10 22 25 25 10

Imunofenotipagem das Leucemias Agudas Dra. Maria Lúcia de Martino Lee Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP/EPM

Imunofenotipagem das leucemias agudas (LA) Principais finalidades Diagnóstico das LA • Definir linhagem/ sublinhagem celular (mieloides, linfoides. B, linfoides T, NK) • Definir estágio maturativo do blasto • Detecção DRM Futuro • Desenvolver e monitorar novas terapias alvo(enzimas de superfície, moléculas de adesão, receptores de citocinas

Citometria de Fluxo Metodologia Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www. cure 4 kids. org.

Citometria de Fluxo Metodologia Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www. cure 4 kids. org.

Citometria de Fluxo Vantagens do método • Mede múltiplos parametros em células individuais • Grande número de células analisadas com rapidez • Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos • Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares

Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Imunofenótipo da LLA Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www. cure 4 kids. org.

Desenvolvimento da linhagem mielóide Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www. cure 4 kids. org.

Imunofenotipagem Triagem Inicial – Painel de Marcadores Linhagem Marcadores Imunológicos Linfóide B CD 19 CD 79 a Linfóide T CD 3 CD 7 Anti-MPO CD 45 Mielóide Não específica CD 10 CD 22 CD 13 CD 33 CD 117 CD 34 tdt

Classificação Imunológica das LLA Infantis Marcadores monoclonais CD 19/ CD 79 a CD 10 IMF % Cy Igs CD 3 cy casos Comum + + Pré B + + + - - 20 -25 t(1; 19) B + +/- - + - 3 t(8; 14) T - +/- - - + 18 Pró B + - - - 1 - - - 50 -60 TEL-AML, Hiperdiploidia MLL, t(4; 11) Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Classificação Imunológica da LLA T Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www. cure 4 kids. org.

Classificação Imunológica da LLA T Marcadores positivos • CD 3 c, CD 7 • CD 5, CD 2, tdt • CD 10 (45 %) • CD 45 Marcadores positivos/negativos • CD 19, CD 13, CD 33 Marcadores negativos • CD 79 a • MPO • CD 1 a, CD 3, CD 4, CD 8 <45 % casos • Subdividida 3 estágios maturativos: Dificíl correlação prognóstica

LLA com co-expressão de antígenos mielóides • Crianças: 4 -35 % • Sem valor prognóstico independente CD 10 CD 19 CD 79 CD 33 (25%) CD 22 cy tdt CD 13 (23%) CD 15 (16%) CD 14 (16%)

Imunofenotipagem na LMA Essencial: – LMA -MO – LMA - M 7 Auxiliar: – LMA -M 6 – LMA - M 3 – LMA - 2 v – LMA -M 4 Eo – LMA - M 5

Imunofenotipagem das LMA minimamente diferenciada Marcadores positivos CD 13 CD 33 CD 117 -------------CD 34, 38, HLA-dr, tdt 1/3 dos casos Marcadores negativos MPO CD 3 c CD 79 a c CD 22 c -----------CD 11 b, 15, as vezes CD 2, 7, 19 fracos

Leucemia Megacarioblástica Aguda Marcadores Positivos • Plaquetários: – CD 41, CD 42, CD 61 Marcadores Negativos ou Positivos: • Mielóides: – CD 13 +, CD 33+, CD 117+ Marcadores Negativos: – anti MPO, CD 34, CD 45, HLA - DR

Eritroleucemia Marcadores positivos • Mielóides: – CD 117, CD 13 • Eritróides: – Glicoforina A Marcadores negativos • anti MPO

Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Leucemia Aguda de Linhagem Ambígua • Leucemias agudas indiferenciadas • Leucemias agudas bifenotípicas • Leucemias agudas bi-linhagem

Leucemias Agudas Indiferenciadas • 1 - 3% leucemias agudas • Amplo painel de marcadores negativos • Em geral: CD 34+, HLA-DR+, CD 38+, CD 7+, tdt+.

Leucemias Agudas Bifenotípicas • Concomitância de marcadores imunológicos no mesmo blasto – Mielóide + B – Mielóide + T –T + B CD 19 • 4 -6% das leucemias agudas MPO CD 22 CD 19

Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.

Leucemia aguda bi-linhagem • Duas populações distintas de blastos expressando marcadores diferentes CD 22 CD 33 CD 19 CD 13 CD 79 a MPO CD 33 MPO CD 19 CD 13 MPO CD 22 CD 33 MPO CD 79 a CD 33 CD 19

Doença Residual Mínima • Técnicas moleculares (FISH, RT-PCR) • Citometria de fluxo: – fenótipos anômalos – Assincronismo maturativo – Infidelidade linhagem – Anormalidades quantitativas – Ausência de antígenos

DRM em LLA - SLE Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.

Recidiva LLA vs DRM Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.