V Transport cytosol reticulum endoplasmique 1 Schma du

V - Transport cytosol reticulum endoplasmique 1

Schéma du routage

Le reticulum endoplasmique • Chez tous les eucaryotes • Plus de la moitié des membranes de la cellule • Membrane continue, lumière continue • 10 % du volume de la cellule

Principaux rôles • Synthèse des lipides et des protéines • Site de production de toutes les protéines transmembranaires et lipides organites de la cellule – RE, Golgi, Lysosomes, Endosomes, Vésicules sécrétoires, Membrane plasmique – Lipides membranes de mitochondries et peroxysomes (pas toutes) – Protéines destinées à l'extérieur – Protéines destinées à lumière de RE, Golgi, Lysosome passent par le RE

AC contre une protéine résidente du RE

• AC contre une protéine résidente du RE Fig 12 -35 • Cellule de plante vivante + protéine fluorescente

Thiéry, G 1983 Fig 1

Thiéry, G 1983 Fig 3

Thiéry, G 1983 Fig 4

Thiéry, G 1983 Fig 6

Bergeron, M 1981 Sch 1

Généralités • Le RE capture les protéines à partir du cytosol – protéines transmembranaires : destinée RE ou autre (membrane plasmique, … , ) – protéines solubles : destinée lumière d'un organite ou sécrétion • Même signal de tri au départ dans le RE

Rappel : les deux types d'import • Post-traductionnel – mitochondrie, noyau, peroxysomes • Co-traductionnel – RE – pas de risque de repliement de la protéine avant son insertion pas besoin de chaperones – nécessité de fixer les ribosomes sur le RE granulaire (REG)

RE granulaire en microscopie électronique

Les deux populations de ribosomes • Ribosomes liés : protéines transloquées dans le RE • Ribosomes libres : toutes les autres protéines • Ont la même structure • Fonctionnent de la même façon • La différence est la protéine qui est en train d'être synthétisée

Le RE granulaire Fig 12 -36

Polyribosomes attachés à la membrane du RE

Il n'y a pas de signal RE Fig 12 -37(A)

Le signal RE de la nouvelle chaîne dirige le ribosome vers la membrane du RE Fig 12 -37(B)

Le RE lisse • C'est du RE sans ribosomes • Toutes les cellules en ont – élément de transition d'où bourgeonnent les vésicules – en continuité avec le REG • Très développé dans les cellules qui ont un métabolisme lipidique important – eg : les cellules qui fabriquent des hormones stéroïdes à partir du cholestérol

REL abondant dans une cellule de Leydig Fig 12 -38(A)

Reconstruction 3 -D de REG et REL dans un hépatocyte Fig 12 -38(B)

Rôle de REL dans le métabolisme des lipides • Hépatocyte : lieu de production des particules de lipoprotéines (transporteurs des lipides) • Enzymes de synthèse localisées dans la membrane du REL • Détoxification – cytochrome P 450 (solubilise des toxiques) – phénobarbital doublement de la surface du REL en quelques jours puis résorption par autophagocytose

Autres rôles du REL • Séquestration du calcium • Beaucoup de Calcium Binding protein • Exemple : le reticulum sarcoplasmique Ca++ATPase qui pompe le Ca++ vers la lumière

Microsomes • Origine technique de préparation de laboratoire • Petites vésicules fermées • Granuleuses ou lisses • Proviennent de toutes les membranes de la cellule • Sont fonctionnels (synthèse de protéines, glycosylation des protéines, captage du Ca++, synthèse de lipides)

Origine des microsomes • Lisses : membrane plasmique, Golgi, endosomes, mitochondries … – exception : hépatocyte où REL microsomes lisses • Granulaire : RER uniquement

Isolement de microsomes rugueux et lisses à partir du reticulum endoplasmique Fig 12 -39(A)

Microsomes rugueux Fig 12 -39(B)

Reticulum endoplasmique rugueux et microsomes rugueux

Comparaison REG REL • • Continuité de membrane Continuité de lumière Grande similitude de protéines Plus de 20 protéines en plus dans le REG il existe une séparation entre les deux – protéines de liaison des ribosomes à la membrane – protéines qui donnent la forme aplatie au REG – interactions entre les protéines spécifiques ? ou réseau sur une des deux faces

Découverte du signal peptide • Au début des années '70 • Protéines sécrétées • ARNm + ribosomes (sans microsomes) in vitro protéines plus longue que la protéine normale (leader peptide en plus) • ARNm + ribosomes + microsomes granuleux protéines de taille correcte • hypothèse du signal : – le leader peptide sert de signal pour diriger la protéine vers le RE – clivage par une signal peptidase dans la membrane du RE avant la fin de la synthèse

Le clivage a lieu dans la lumière du RE • Synthèse de la protéine sans microsome + protéase dégadation de la protéine • Synthèse de la protéine avec microsome + protéase pas de dégradation de la protéine (protection par la membrane du microsome) • Protéines sans signal ne sont pas importées dans les microsomes dégradation

Hypothèse du signal • S'applique : – plante + animal + membrane plasmique de la bactérie – mitochondrie, chloroplaste, peroxysome – protéines sécrétées – en fait toutes les protéines fabriquées par les ribosomes liés • Confirmée par les résultats à partir de protéines de fusion

• Hypothèse originale du originale signal peptide Fig 12 -40

Guidage de la séquence signal RE • Signal Recognition Particle (SRP) – navette entre membrane du RE et cytosol – se lie à la séquence signal • Récepteur de SRP dans la membrane du RE

Signal Recognition Particle • Très conservé • 11 S RNP • 6 chaînes polypeptidiques différentes : 72, 68, 54, 19, 14, 9 – SRP 68/72, 19, 54 : liaison au centre = domaine S • 1 molécule d’ARN (300 nucléotides appelé 7 SL RNA)

Anatomie fonctionnelle de SRP • 2 extrémités – liaison au ribosome et blocage de la traduction – liaison à la séquence signal RE du polypeptide en élongation • 3 sites de reconnaissance – Ribosome – Séquence du signal RE – Récepteur de SRP

Signal Recognition Particle (SRP) bactérie Fig 12 -41

Liaison au signal RE du polypeptide en élongation • Poche bordée d’acides aminés hydrophobes (riche en méthionine domaine M) donc très flexible • grande flexibilité pour s'adapter à beaucoup de types de protéines

Séquence signal du Reticulum endoplasmique • Grande variation dans la séquence des acides aminés • 8 ou plus acides aminés non polaires à leur centre • Peut être accepté par la poche hydrophobe de SRP

• Chez eucaryote – 2 domaines • Alu : SRP 14 et 9 • S : SRP 72/68 et 19 54 • SRP 54 – Domaine M(ethioninerich) – Domaine N(terminal) G(TPase) Ffh = homologue de SRP 54 Wild, K 2002 fig 1

Crystal structures of three protein–RNA subcomplexes from the SRP Wild, K 2002 fig 2

Fold of SRP RNA-binding proteins compared with common RNA-binding domains Wild, K 2002 fig 3

Structure and assembly of the Alu domain of the SRP H. sapiens S. pombe B. subtilis Proposed hierarchical assembly pathway for the mammalian Alu RNP Wild, K 2002 fig 4

(a) Overall structure (b) A comparison of the GNAR and GNRA tetraloops Wild, K 2002 fig 5 The structure of the human SRP 19–helix 6 complex

Towards the structure of the mammalian SRP Wild, K 2002 fig 6

7 S RNA 4. 5 S RNA Stroud, RM 1999 Fig 2

Domaine M(éthionine rich) de Ffh + Stroud, RM 1999 Fig 3 -

Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE • Liaison de SRP à la séquence signal • Arrêt de la synthèse protéique • Fixation du ribosome à la membrane du réticulum endoplasmique →pas de libération prématurée (lysosome) • Fixation du complexe SRP-ribosome au récepteur du SRP • Rapprochement du complexe vers un translocateur • Libération de SRP de son récepteur • Translocation de la chaîne protéique naissante à travers la membrane du réticulum endoplasmique

• Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Fig 12 -42(A)

• Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Fig 12 -42(A)

• Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Fig 12 -42(B)

Résumé : les 5 acteurs • Cytosol – SRP – Séquence signal RE de la chaîne naissante – Ribosome • RE – SRP-r – Translocateur

• Aspect énergétique : GTP Stroud, RM 1999 Fig 1

Le translocateur : Sec 61 • Pore aqueux • 3 à 4 complexes protéiques • Chaque complexes = 3 - 4 protéines transmembranaires • Structure en beignet • Alignement du translocateur avec le tunnel de la grosse sous - unité du ribosome • Puis "soudure" translocateur - ribosome

Science, Vol 278, Issue 5346, 2123 -2126 , 19 December 1997 Alignment of Conduits for the Nascent Polypeptide Chain in the Ribosome. Sec 61 Complex Roland Beckmann, Doryen Bubeck, Robert Grassucci, Pawel Penczek, Adriana Verschoor, Günter Blobel, Joachim Frank. Three-dimensional reconstruction of the ribosome. Sec 61 complex in a surface representation

Three closeup views of the Sec 61 oligomer. (A) Surface facing the ribosome. There is a vestibule (diameter of 35 Å) formed by the funnel-like structure and the pore (diameter of 15 Å). (B) Surface facing away from the ribosome. (C) View of the side opposite the attachment site. The ribosome would be located underneath the channel. The wall opposite the attachment site is thinner and more irregular. Arrows indicate the attachment site. Scale bar, 50 Å. Science, Vol 278, Issue 5346, 2123 -2126 , 19 December 1997 Alignment of Conduits for the Nascent Polypeptide Chain in the Ribosome. Sec 61 Complex Roland Beckmann, Doryen Bubeck, Robert Grassucci, Pawel Penczek, Adriana Verschoor, Günter Blobel, Joachim Frank

"Soudure" entre le ribosome et le translocateur (Sec 61) – A - Vue latérale ribosome - Sec 61 – B - Vue du cytosol – C - Schéma Fig 12 -43

• Mise en évidence de la soudure étanche entre ribosome et translocateur (Sec 61) Fig 12 -44

Le pore aqueux • Continuum entre le tunnel du ribosome et le canal aqueux du translocateur • Le pore n'est pas ouvert en permanence : se referme pour éviter la fuite du Ca++ du RE vers le cytosol • Structure dynamique • C'est la séquence signal qui ouvre le pore au bout d'un certain temps d'alongement de la chaîne • 2 reconnaissances de la séquence signal – SRP – translocateur (pour ouvrir le pore)

Le transport n'est pas toujours co-traductionnel • Levure, paroi bactérienne ( RE)

• Translocation cotraductionnelle Fig 12 -45(A) Pas de nécessité d'énergie (pour l'importation)

Translocation post traductionnelle • Sec A – – – que dans les bactéries pas de Sec 61 moteur protéique c'est une ATPase fonctionne comme un piston • Bip (Binding protein) – – c'est une proteine chaperonne hsp 70 se fixe sur la chaîne en émergence grâce à d'autres Sec fixées à Sec 61 cycle de liaison et libération translocation

Des Sec supplémentaires déposent des molécules de Bip sur la chaîne émergeante. Liaison et libération de Bip tirent sur la chaîne (comme le cliquet dans la mitochondrie). Intervention de Sec A ATPase (exclusivement dans les bactéries) (piston) • Fig 12 -45(BC) Translocation posttraductionnelle

La signal peptidase • Clive la séquence signal dans la lumière du RE • Nécessite un site de reconnaissance différent de la séquence signal • Les séquences signal RE situées à l'intérieur du polypeptide ne sont jamais clivées (pas de site de reconnaissance pour la signal peptidase) • Mais servent à retenir les protéines transmembranaires

Les deux fonctions de la séquence signal • Guide la protéine vers le reticulum endoplasmique • Sert de signal de transfert "start" pour ouvrir le pore (start transfert signal)

La séquence signal • Contact avec Sec 61 ET les lipides de la membrane • Il y a ouverture latérale du pore pour libérer la séquence signal clivée • Il y a deux ouvertures dans le translocateur (pore + sortie latérale)

Translocation dans le réticulum endoplasmique 1. Protéines solubles 2. Protéines membranaires

• 1 - Translocation d'une protéine soluble Fig 12 -46

2 - Trois modèles d'insertion d'une protéine transmembranaire à un passage dans la membrane du RE • Modèle 1 • Modèle 2 • Modèle 3

Modèle 1 • idem protéine soluble mais segment hydrophobe en plus… – donc présence d'une séquence signal qui est le start transfert signal ( autres modèles) • … qui bloque le transfert (signal d'arrêt de transfert) (stop transfert sequence) • qui ancre la protéine dans la membrane une fois le signal start libéré • Extrémité -N luminale

• Protéine transmembranaire à un passage : modèle 1 (-N luminal) Fig 12 -47

Modèle 2 • La séquence signal est interne et sert de signal start à la translocation : c'est le segment de protéine suivant la séquence signal qui est transloqué dans la lumière du RE • Extrémité -N cytosolique

• Protéine transmembranaire à un passage : modèle 2 (-N cytosolique) Fig 12 -48(A)

Modèle 3 • La séquence signal est interne et sert de signal start à la translocation : c’est le segment de protéine précédent la séquence signal qui est transloqué dans la lumière du réticulum endoplasmique • Extrémité –N terminale

Fig 12 -48(B) • Protéine transmembranaire à un passage : modèle 3 (-N luminal)

Insertion d'une protéine transmembranaire à deux passages dans la membrane du RE • Signal de transfert start suivi d'un signal de transfert stop

• Protéine transmembranaire à deux passages : ( -N et -C cytosoliques) Fig 12 -49

Insertion d'une protéine transmembranaire à plusieurs passages dans la membrane du RE • Signal de transfert start suivi d'un signal de transfert stop • Suivi d'un signal de transfert start… • Suivi d'un signal de transfert stop… • Suivi d'un signal de transfert start. . .

• Insertion de la rhodopsine dans la membrane du RE Fig 12 -50

Établissement d'un cadre de lecture • La SRP balaie la chaîne naissante de -N vers -C • SRP considère la première séquence hydrophobe comme signal start • Puis alternance de stop - start

Asymétrie des membranes • SRP fixe ainsi l'asymétrie des membranes • Cette asymétrie est conservée pendant les phénomènes de bourgeonnement et fusion • Le mode d'insertion d'une nouvelle protéine dans la membrane du RE détermine l'orientation de cette protéine dans toutes les autres membranes • L'asymétrie est inhérente au processus d'insertion dans la membrane et non pas à la protéine elle-même

Rôle de la lumière du RE dans la qualité des protéines • Présence de protéines résidentes du RE – contenant un signal de rétention RE : -Lys-Asp-Glu-Leu-COO- • Aide à l'assemblage et repliement correct des protéines • Exemple 1 : protein disulfide isomerase (PDI) • Exemple 2 : binding protein (Bi. P)

Exemple 1 : Protein Disulfide Isomerase (PDI) • catalyse l'oxydation des – SH de cystéines en S – S • le cytosol a un environnement réducteur ( excès d'électrons – SH prédominant)

Exemple 2 : Binding Protein (Bi. P) • Bi. P reconnaît les protéines mal repliées • Se comporte comme la famille des hsp 70 pour l'importation dans les mitochondries – Capable d'hydrolyser ATP • se fixe sur les séquences d'acides aminés qui devraient être – soit enfouies – soit nécessaires à l'assemblage de la chaîne – eg alternance d'acides aminés hydrophobes et hydrophiles qui devraient faire des plis • Aide à maintenir de telles protéines dans le RE

Nat Struct Biol : Albanèse, V 2002(fig 1) • Rôle du site de sortie du ribosome dans le repliement des protéines chez les bactéries et dans la sécrétion protéique des eucaryotes

Glycosylation dans le réticulum endoplasmique • Une des principales fonctions du réticulum endoplasmique glycoprotéines – Presque toutes les protéines fabriquées dans le RE solubles et membranaires sont glycosylées • Les protéines du cytosol le sont très peu • Glycosylation dans le Golgi (plus rare) – O lié sur le OH d'une sérine ou thréonine ou hydroxylysine (cf. infra)

• Précurseur oligosaccharidique ajouté à presque toutes les protéines du réticulum endoplasmique granulaire Fig 12 -51

Glycosylation dans le réticulum endoplasmique – Intervention de oligosaccharyltransférase – a lieu pendant la synthèse de la protéine – Le plus souvent N lié sur une asparagine Fig 12 -52

• Intervention du dolichol Fig 12 -53

Importance de la glycosylation • Certaines protéines ont besoin d'être Nglycosylées pour se replier correctement • Intervention de deux protéines chaperone du RE – calnexine – calréticuline

Calnexine et calréticuline • Nécessitent du Ca++ pour leur activité • Sont des lectines • Se lient aux oligosaccharides protéines mal repliées • et les retiennent dans la lumière du RE • Empêche l'agrégation des protéines mal repliées • Reconnaissent les oligosaccharides N-liés qui ont un simple glucose terminal • donc interviennent après la suppression de 2 des 3 glucoses de l'oligosaccharide • Calnexine : membrane du RE • Calréticuline : lumière du RE

Comment calnexine et calréticuline reconnaissent-elles une protéine bien repliée d'une protéine insuffisamment repliée ? • Intervention d'une autre enzyme du RE : une glycosyl-transférase • qui ajoute toujours un glucose aux oligosaccharides qui ont perdu leur dernier glucose et qui sont attachés à une protéine mal repliée • Cycle glucosidase (ablation) / glycosyl transférase (addition)

• Rôle de la glycosylation N-liée dans le maintien du repliement correct des protéines Fig 12 -54

Dislocation des protéines du RE vers le cytosol • Beaucoup de protéines arrivent dans la lumière du RE mal ou pas repliées • Elles retournent dans le cytosol par le même Sec 61 (rétrotranslocation appelée dislocation) où elles sont dégradées • Comment sont-elles reconnues ? • Un fois dans le cytosol, les oligosaccharides sont retirés par une glycannase • Puis ubiquitinylation • Dégradation dans les protéasomes

• Retour des protéines du RE mal repliées vers le cytosol • Même sort pour protéines solubles et membranaires Fig 12 -55 Intervention de protéines accessoires associées au translocateur pour fonctionner dans les deux sens

Réponse à une augmentation de protéines mal repliées • Si protéines mal repliées – Dans le cytosol chaperones cytosoliques – Dans le RE, de la transcription des gènes qui codent pour les chaperones du RE • La voie de signalisation vers le noyau est bien connue chez la levure… • Exemple de régulation par épissage d'un ARN messager (!)

Fig 1256(A) Réponse chez la levure à une augmentation de protéines mal repliées

Ancrage d'un GPI (Glycosyl Phosphatidyl Innositol) à une protéine membranaire • Dans le cytosol il y a addition de chaînes d'acide gras ou de prényl à des protéines pour qu'elles deviennent membranaires • idem pour les protéines du RE : liaison d'un GPI à la protéine qui deviendra membranaire • Une fois dans la membrane plasmique, pourra être libérée facilement par une phospholipase

• Attache d'un GPI à une protéine dans le RE Fig 12 -57

Rôle du réticulum endoplasmique dans la synthèse des lipides membranaires • Le RE synthétise presque tous les lipides membranes (phospholipides, cholestérol. . . ) • La synthèse a lieu dans le feuillet cytosolique de la membrane du RE • idem pour PC (=lécithine), PE, PS et PI • Action d'une scramblase pour équilibrer les deux feuillets (flip-flop normalement rare) – scramblase : non spécifique (équilibre quantitatif) – flippase : spécifique (maintien de l'asymétrie)

• Synthèse de la phosphatidyl choline (PC) Fig 12 -58(A)

• Synthèse de la phosphatidyl choline (PC) Fig 12 -58(B)

• Membrane du RE • Rôle des translocateurs phospholipidiques : la scramblase Fig 12 -59(A)

• Membrane plasmique • Rôle des translocateurs phospholipidiques : flippase ( PS et PE vers la face cytosolique) Fig 12 -59(B)

Autres lipides membranaires • Céramide glycolipides et sphingomyéline dans le Golgi • Autres membranes

Les deux systèmes de membrane • Membrane plasmique, RE, Golgi, Lysosomes, endosomes, vésicules : échange des lipides et protéines (trafic membranaire) • Mitochondries, peroxysomes (? ) sont exclus de ce système – protéines : importées du cytosol – lipides : à importer du RE directement ou indirectement protéines d'échange des phospholipides

Protéines d'échange des phospholipides • Transporteurs solubles de lipides • Extraction suivie de diffusion • Transportent une molécule de phospholipide à la fois • Se fait d'une membrane riche vers une membrane pauvre

Fig 12 -60 Protéines d'échange des phospholipides Équilibrage des deux feuillets ? Membrane interne de la mitochondrie ?