Il Sistema Immunitario Patogeno qualsiasi organismo dotato del

Il Sistema Immunitario

Patogeno è qualsiasi organismo dotato del potenziale di provocare una malattia. Divisi in 4 categorie: batteri, funghi, virus, parassiti Patogeno opportunista: colonizza l’organismo senza provocare una malattia. Può divenire patogeno se le difese sono indebolite. Batteri SARS virus Parassiti nei globuli rossi Fungi

L’organismo reagisce all’invasione di un patogeno con due tipi di risposta: -Risposta immunitaria innata -Risposta immunitaria acquisita >umorale (cellule B , anticorpi) >cellulo-mediata (cellule Tc e Th) Il Sistema immunitario deve essere in grado di disitinguere il self dal non-self (tolleranza verso il self)

IMMUNITA’ innata acquisita • aspecifica • riconosce strutture comuni • sempre operativa • sempre uguale • specifica • previene l’infezione • richiede l’infezione • riconosce strutture specifiche • consegue al contatto • potenziata da contatti ripetuti

IMMUNITA’ INNATA • Comprende 4 tipi di barriere: – Anatomica • Cute • Superficie delle mucose – Fisiologica • Temperatura • p. H • Fattori solubili – Endocitica/fagocitica • fagocitosi – Infiammatoria • Complesso Risposta infiammatoria

Cute : Mucose: -barriera meccanica ritarda l’ingresso dei microbi - l’ambiente acido(p. H 3 -5) ne ritarda la crescita - la flora normale compete con i microbi per i siti di attacco e i nutrienti -il muco intrappola i microrganismi interi - Le ciglia spingono i microrgansimi fuori dal corpo Temperatura: -la normale t inibisce la crescita di alcuni patogeni -la febbre inibisce la crescita di alcuni patogeni p. H: - l’acidità gastrica uccide la maggior parte dei patogeni ingeriti Mediatori chimici: -lisozima scinde la parete batterica -interferone induce uno stato antivirale nelle cellule infettate - Il sistema del complemento lisa i mocrorganismi e facilita la fagocitosi

• • • 1 -2 adesione del batterio a lunghe evaginazioni della membrana (pseudopodi) 3 - ingestione del batterio con formazione del fagosoma che si muove verso il lisosoma 4 - fusione del fagosoma e lisosoma con rilascio di enzimi lisosomiali nel fagosoma 5 - digestione del materila ingerito 6 - rilascio di prodotti di digestione della cellula Fagocitosi

• I fagociti che riconoscono le comuni componenti delle pareti batteriche innescano l’immunità innata e inducono l’infiammazione • I fagociti sono di due tipi: – Macrofagi – Neutrofili • I macrofagi sono presenti nei tessuti • I neutrofili circolano nel sangue e penetrano solo in quelli infetti • Essi espongono recettori di superficie che si legano ai comuni carboidrati della parete batterica, componenti che non sono presenti nella cellula umana • In risposta alla presenza dei batteri i macrofagi secernono proteine solubili, dette citochine, che reclutano altre cellule del sistema immunitario. • I neutrofili sono cellule specializzate nella fagocitosi e nell’uccisione dei patogeni. Iniziano ad agire subito dopo l’infezione. Sono capaci di agire anche in condizioni di anaerobiosi. Muoiono nel sito di infezione formado pus. Producono l’infiammazione.

INFIAMMAZIONE Il danno tissutale provoca il rilascio di vari fattori vasoattivi e chemiotattici. Questi fattori inducono aumento del flusso sanguigno nell’area, aumento della permeabilità capillare e afflusso dei globuli bianchi, tra cui fagociti e linfociti. Le proteine seriche contenute nell’essudato hanno proprietà antibatteriche e i fagociti incominciano a fagocitare i batteri Tra i principali mediatori chimici ci sono: proteine della fase acuta istamina chinine

• Compito del sistema immunitario innato è anzitutto quello di riconoscere e quindi distinguere cellule che fanno parte del self, ovvero cellule proprie dell’individuo, da quelle esterne di origine batterica. • Ciò è possibile in quanto tutte le cellule batteriche hanno una caratteristica comune, ovvero quella di concludere l’estremità Nterminale di ogni peptide una formil-metionina al posto di una metionina. Inoltre il sistema immunitario innato è in grado di riconoscere anche la struttura lipopolisaccaridica della parete esterna dei batteri e anche il tipo di acido nucleico presente in essi. • La specificità di queste varie capacità di riconoscimento è affidata a particolari recettori detti “toll-like receptors”, proteine la cui origine , si è visto, è molto antica nella scala dell’evoluzione degli organismi viventi.

La famiglia Toll-like receptor (TLR) appartenenti al Pattern di Recettori di Ricognizione Peptidoglycan (G+) Lipoprotein Lipoarabinomannans Zymosan (Yeast) GPI protein TLR-6 TLR-2 LPS(G-) RSV F TLR-1 CD 14 MD-2 TLR-4 ds. RNA TLR-3 Flagellin TLR-5 Bacterial Cp. G DNA TLR-9

CELLULE E ORGANI DEL SISTEMA IMMUNITARIO

Il Sistema immunitario: meccanismi di base Componenti del sistema immunitario: organi linfatici e leucociti. Organi linfatici: i leucociti si sviluppano fino alla maturità negli organi linfatici PRIMARI (il midollo osseo e nel caso dei linfociti T, il timo). Gli organi linfatici periferici mostrano un’architettura reticolare che intrappola materiale estraneo presente nel sangue (milza), nella linfa (linfonodi), nell’aria (tonsille e adenoidi) e in cibo e acqua (appendice vermiforme e placche di Peyer nell’intestino). Leucociti: si dividono in neutrofili, monociti e macrofagi (dai monociti), cellule fagocitarie che “inglobano e distruggono” agenti estranei e detriti; gli eosinofili ed i basofili proteggono invece dai grandi parassiti e sono coinvolti nelle reazioni allergiche. Linfociti: si dividono in B (cellule B) e T (cellule T), specifici rispetto agli agenti esterni. I linfociti non B e non T sono “natural killer (NK)” antivirali.

Organi del Sistema immunitario Tonsille e adenoidi Linfonodi Vasi linfatici Timo Linfonodi Milza Placche di Peyer Appendicite Linfo nodi Midollo osseo Vasi linfatici

• Gli organi linfatici primari forniscono la sede in cui i linfociti differenziano e vengono commissionati per l’antigene. • I linfociti T maturano nel timo • I linfociti B maturano nel midollo osseo (borsa di Fabrizio negli uccelli) • In entrambi i casi un processo selelttivo elimina i linfociti immaturi che riconoscono molecole self oppure riconoscono il MHC autologo

• Gli organi linfatici secondari catturano l’antigene e forniscono la sede in cui i linfociti possono interagire con esso, andando incontro alla proliferazione e alla differenziazione in cellule effettrici • Il tessuto linfatico drena i tessuti e li intereconnette gli uni agli altri • I linfonodi sono specializzati nel catturare gli Ag presenti nei tessuti • La milza riceve gli Ag direttamente dal sangue • Il tessuto meno organizato si trove nelle membrane delle mucose (follicoli linfatici dispersi nella lamina dell’intestino e nelle placche di Peyer, site nella parete intestinale) • Si possono individuare anche tessuti linfatici terziari: tessuti linfatici associati alla cute

NEI TESSUTI SECONDARI AVVIENE L’INCONTRO DEI LINFOCITI CIRCOLANTI CON I PATOGENI E I LORO PRODOTTI METABOLICI TRASPORTATI DA UN SITO DI INFEZIONE

CELLULE

• Emopoiesi è il processo che porta alla formazione di cellule del sangue mature. • Le sedi dell’emopoiesi sono diverse nel feto, rispetto all’adulto. • Nel feto sono organi emopoietici: il sacco vitellino, il fegato, la milza, il timo, il midollo osseo. Nell’adulto il principale organo emopoietico è il midollo osseo delle ossa piatte e delle estremità delle ossa lunghe che produce tutti gli elementi figurati del sangue. • • Tutti derivano da una cellula capostipite denominata emocitoblasto, capace di differenziarsi poi nelle differenti linee. • Emocateresi è il processo che porta alla distruzione della cellule del sangue. Principali organi che svolgono questo ruolo sono il fegato e la milza

Cellule della linea linfatica • Linfociti sono il 20 -40% dei globuli bianchi e 99% delle cellule presenti nella linfa • Nel corpo umano ci sono circa 1011 linfociti • Circolano nel sangue e nella linfa e possono migrare nei diversi tessuti e organ. I linfatici • Si dividono in – Linfociti B – Linfociti T – Linfociti null (cellule natural Killer)

• I linfociti B e T quiescenti sono piccoli, mobili, indistinguibili morfologicamente • Quelle che non hanno incontrato l’Ag sono vergini (naive) e sono quiescenti nella fase Go del ciclo cellulare (diametro 6 mm, piccoli linfociti) – Citoplasma scarso, cromatina molto addensata, pochi mitocondri RE e Golgi poco sviluppati • I linfociti che incontrano l’Ag diventano attivati ed entrano nella fase G 1, S, G 2 e M del ciclo cellulare. – Aumentano di volume (diametro 15 mm cellule blastiche o linfoblasti) e si sviluppano gli altri organuli cellulari I linfociti proliferano e differenziano in cellule effettrici e cellule della memoria

Linfociti B • Maturano nel midollo osseo • Esprimono sulla superficie un recettore (Ab) specifico per un antigene (Ab=antibody anticorpo) • Dopo l’incontro con l’Ag maturano e si differenziano in Linfociti B della memoria e linfociti effettori (plasmacellule) • Linfociti B della memoria esprimono lo stesso Ab delle cellule progenitrici • Una plasmacellula sercerne più di 2. 000 Ab al secondo • Le plasmacellule muoiono in 1 -2 settimane

Altre molecole di membrana dei linfociti B • B 220 marcatore della linea linfocitaria B e dei suoi precursori • Molecole MHC di classe II permette al linfocita B di comportarsi come cellule presentante l’Ag • CR 1 e C 2 recettori per alcuni prodotti del complemento • Fcg/RII recettore per Ig. G • B 7 -1 e B 7 -2 interagiscono con CD 28 e CTLA-4, importanti molecole presenti sui linfociti T • CD 40 interagisce con il CD 40 -ligando sulla superficie del linfocita T H

Cellule T • Nascono nel midollo osseo e maturano nel timo • Durante la maturazione esprimono sulla membrana uno specifico recettore per l’Ag: recettore del linfocita T (T cell receptor TCR) • TCR riconosce Ag solo se è legato a proteine MHC, glicoproteine polimorfiche, presentate da altre cellule • Ci sono 2 sottopopolazioni di linfociti T: – T helper (TH) – Th 1 e Th 2 – T citotossiche (Tc) o killer

VH VH V CH 1 VL VL CL CL CH 2 Iga/Igb CH 3 V g e e d C C z z Iga/Igb fyn lck Zap 70 Blk, Fyn or Lyn RECETTORE CELLULE B RECETTORE CELLULE T

Cellule null • Non esprimono le molecole caratteristiche dei linfociti T e B • Sono prive degli attributi fondamentali dell’immunità: la specificità e la memoria • Comprendono i linfociti natural killer (NK) • Sono di aspetto granulare e rappresentanto il 5 -10% dei linfociti del sangue • Svolgono un ruolo importante nei confronti delle cellule tumorali e infettate da virus

Cellule dendritiche • Le cellule dendritiche sono globuli bianchi che attivano il sistema immunitario catturando gli antigeni ed esponendoli all’azione delle cellule 'killer', i linfociti T. • Queste cellule risiedono principalmente a livello di quei tessuti che fungono da barriera con l'ambiente esterno e quindi sono più facilmente raggiungibili da agenti patogeni (mucosa nasale, polmonare, intestinale, gastrica e cute), dove ricoprono il ruolo di vere e proprie 'sentinelle'. • Quando vengono a contatto con agenti estranei migrano a livello di quei tessuti che servono da basi al sistema immunitario (linfonodi), dove allertano le altre cellule di questa complicata macchina che ci difende dall'insorgenza di nuove malattie.

ANTIGENI

• Antigeni sono sostanze in grado di indurre una risposta immunitaria • Ci sono differenze fondamentali nel modo in cui i linfociti B e T riconoscno l’Ag • Immunogenicità e antigenicità sono due propietà immunologiche correlate, ma distinte • Un antigene è un immunogeno e l’antigenicità è la sua capacità di reagire in maniera specifica con i prodotti finali delle risposte immuni • "TUTTI GLI IMMUNOGENI SONO ANTIGENI, MA NON TUTTI GLI ANTIGENI SONO IMMUNOGENI".

APTENE: molecola solitamente di piccole dimensioni che hanno la proprietà di essere antigeniche, ma che di per sé non è in grado di evocare una risposta immunitaria (sono prive di immunogenicità). Può diventare anche immunogenica se si lega a una molecola carrier. Può reagire con i prodotti di una risposta immune specifica.

Proprietà dell’immunogeno • Estraneità: tanto maggiore è la distanza filogenetica fra due specie, tanto maggiore è la lo diversità genetica • Peso molecolare: macromolecole > 10 k. Da • Composizione ed eterogenità chimica: – omopolimeri scarsa immunogencicità – Copolimeri EKEKEK…. . richiede un PM di 30. 000 per essere immunogeno, se si aggiunge anche Y EKYEKY……. il PM si riduce a 20. 000 • Capacità di essere processato: le macromolecole devono essere processate dalle cellule che presentano l’Ag. Più alta è quasta capacità maggiore è l’immunogenicità

Ruolo del sistema biologico nell’immunogencità • Lo sviluppo di una risposta immunitaria dipende da alcune caratteristiche del sistema biologico con cui l’agente entra in contatto: • Genoma ospite • Dose e via di somministrazione: gli immunogeni sperimentali sono somministrati per via parentale • Associazione di altre sostanze (adiuvanti): sostanze che unite a un Ag e iniettate con esse, ne aumentano l’immunogenicità. Uno dei più usati è l’adiuvante di Freund che contienen l’Ag in una soluzione acquosa, olio minerale ed agente emulsionante (monooleato di mannite) che disperde l’olio in piccole gocce intorno all’Ag. Si ottine un lento rilascio dell’Ag dal sito di inoculazione

EPITOPO O DETERMINANTE ANTIGENICO: PARTE DI UN ANTIGENE CHE ENTRA IN CONTATTO CON IL SITO DI LEGAME DI UN ANTICORPO O COL RECETTORE PER L’Ag DELLE CELLULE T o B. (GLI EPITOPI SONO PRATICAMENTE LE PORZIONI PIÙ IMPORTANTI DELL’ANTIGENE, CAPACI DI EVOCARE LA RISPOSTA IMMUNITARIA).

Quando i farmaci diventano immunogeni • I farmaci sono piccole molecole incapaci di scatenare la risposta immunitaria se non sono associate a una molecola più grande • La penicillina in alcuni individui può reagire con alcune proteine dell’organismo per formare un derivato penicilloil-proteina (aptene-vettore), in cui il derivato penicillinico, il gruppo penicilloil, ha la funzione di epitopo aptenico • Questo epitopo è riconosciuto dal sistema immunitario che produce Ab (Ig. E) contro di esso. Le Ig. E vengono trasportate in tutto l’organismo dove vengono riconosciute dai recettori per le Ig. E posti sui basofili (mast-cellule) e rimanere per molto tempo. Se a una persona che ha anticorpi Ig. E contro la penicillina viene somministrata penicillina, andrà incotro a reazione allergica • 1 -5% della popolazione ha questo problema

SISTEMA IMMUNITARIO ACQUISITO

Sistema immunitario specifico Origine Linfociti: 1. Linfociti T 2. Linfociti B

• • La selezione clonale dei linfociti B e linfociti T è alla base della risposta innata Sia i linfociti B che T esprimono recettori dotati di una singola specificità – Linfociti B esprimono immunogobuline (Anticorpi, Ab) – Linfociti T esprimono recettori VL VH VH CH 1 CL CH 2 Iga/Igb CH 3 V V VL zz CL ge C C ed CH 2 CH 3 Iga/Igb fyn lck Zap 70 Blk, Fyn or Lyn • Ciascun linfocita da origine a un unico tipo di molecola • Ciascun linfocita, stimolato dal patogeno da origine a una popolazione di cellule che esprimono tutte immunoglobuline o recettori delle cellule T identici (SELEZIONE CLONALE)

Esempio: SELEZIONE CLONALE nei linfociti B Ogni linfocita B esprime sulla membrana 150. 000 Anticorpi (recettori) identici per lo stesso Ag

Gli strumenti del sistema immunitario acquisito • Immunoglobuline o Anticorpi • Recettore delle cellule T • Complesso maggiore di istocompatibilità e proteine MHC su APC • Cellule che presentano l’antigene (APC)

Immunoglobuline: struttuta e funzione

Antibody Molecule Structure Ag binding region VH N terminal end h t. C ha in disulfide bonds Heavy Chain CHO C H 2 gh VL C H 1 C H 3 Li C terminal end Ag CL = globular domains Y

• • • 2 catene leggere identiche (L, light, 220 aminoacidi) 2 catene pesanti identiche (H, heavy, 440 aminoacidi) A forma di Y rovesciata Ponti S-S fra le catene 2 siti di legame per Ag (bivalenti) Zona di riconoscimento per Ag o Fab (Fragment Antigen Binding) con sequenza di aminoacidi relativamente variabile Zona costante o Fc (Fragment cristallizzabile) con sequenza di aminoacidi relativamente costante REGIONI IPER VARIABILI La variabilità della sequenza di aminoacidi è confinata in 3 regioni ipervariabili (5 -7 aminoacidi per L, 6 -17 aminoacidi per H) Il sito antigenico è composto dalle regioni ipervariabili della catena L e dalle regione ipervariabili della catena H Alta costante di affinità Ig-Ag (104 -1011 l/mole)

Papain Cleavage

Papain Cleavage 2 Fab Fc

Pepsin Cleavage

Pepsin Cleavage F(ab’)2 Enzymatic degradation of Fc fragment.

Funzione effettrice Legame a C 4 b C fissazione (legame a C 1 q ) Si lega a Fc. R (Mac, Mono) Si lega a Fc. R (neutrofili; NK cells)

Come agiscono gli anticorpi • Gli Ab eliminano gli Ag e uccidono i patogeni utilizzando 3 funzioni effettrici principali: – Opsonizzazione (fagocitosi dell’Ag da parte dei macrofagi e neutrofili) – Attivazione del complemento (Ig. M e sottoclassi di Ig. G) – Interazione con i recettori Fc delle cellule NK

Classi di anticorpi Esistono 2 tipi di catene leggere – K (uomo 60%) - l (uomo 40%) Esistono 5 classi di catene pesanti: m, g, , d, e Ognuna di queste diverse catene pesanti è chiamata ISOTIPO Ogni Ab è formato da 2 catene pesanti e 2 catene leggere identiche H 2 L 2, oppure è un multimero di questa struttura base a 4 catene (H 2 L 2)n

5 Classi di anticorpi nell’uomo • Classe catena pesante sottoclassi catena leggera formula molecolare Ig. G g g 1 g 2 g 3 g 4 K, l g 2 K 2, g 2 l 2 Ig. M m nessuna K, l (m 2 K 2)n (m 2 l 2)n n=1 o 5 Ig. A a a 1, a 2 K, l (a 2 K 2)n (a 2 l 2)n n=1, 2, 3, 4 Ig. E e nessuna K, l (e 2 K 2) (e 2 l 2) Ig. D d nessuna K, l (d 2 K 2) (d 2 l 2)

Immunoglobuline: struttura Ig. G, Ig. D, Ig. E, and Ig. A Ig. M

Funzione degli anticorpi • • Ig. G: Coinvolte nella risposta umorale 70% delle Ig sieriche Azioni: – – • • • Opsonizzazione Neutralizzazione di microbi e tossine Attivazione del complemento per via classica Attraversare la placenta Ig. M: Primi a comparire nel sangue in risposta ad antigeni Potere agglutinante a causa dei molteplici siti disponibili Attivatori del Complemento Non attraversano la placenta

• • Ig. A: Ig dimeriche Sintetizzate da linfociti B dei tessuti linfoidi associati alle mucose Presenti nelle secrezioni, latte, saliva, lacrime, etc. – Impediscono l’aderenza di microrganismi. – Scarsa attività opsonizzante – Attivazione del complemento per via alternativa • Ig. E: • Reazioni di ipersensibilità di Tipo I (asma, febbre da fieno) provocando il rilascio di citochine e mediatori infiammatori. • Attivi nelle infezioni da parassiti favorendo l’attività citotossica degli eosinofili. • Ig. D: • Ig di membrana espresse sulla superficie dei linfociti. • Ruolo non chiarito, ma sono importanti drante la differenziazione dei linfociti B.

Ruolo delle Ig. E nella secrezione di istamina Recettore Fc per Ig. E mastocita Ig. E Ag Vescicole di istamina Istamina Vasodilatazione, reazioni allergiche Rilascio di istamina

Il sistema del Complemento Sistema di Proteine attivate enzimaticamente dal legame di un anticorpo ad un antigene che portano alla formazione di un complesso terminale capace di attaccare e dissolvere la parete batterica o la membrana di cellule tissutali. Vie di Attivazione: • Classica - In cui sono presenti tutti i componenti attivata dal complesso antigene-anticorpo • Alternativa – Innescata da membrane microbiche e molecole non anticorpali. Assenza di alcuni componenti. • Lectinica – Attivata da lectine plasmatiche si legano ai microrganismi.

Funzioni: • Interazione con i recettori della superficie cellulare per indurre la fagocitosi – Molecole recettrici su polimorfonucleati, macrofagi e frammento Fc degli anticorpi • Produzione di componenti biologicamente attivi. – Tramite proteolisi il complemento si attiva liberando un frammento b che prende parte ad ulteriori reazioni ed un frammento a che si comporta come mediatore flogistico. • Danno della membrana tramite il complesso d’attacco

Complement C 2 C 3 a C 5 a C 1 C 6 C 8 C 5 b Ig. G Antigen C 7 C 4 Enzyme C 3 b C 5 b C 9

Complesso di attacco alla membrana C 5 70 -100 Å C 8 C 9 C 9 C 9 C 9 C 9 C 6 C 5 b C 7

• Natura especifica • Richiede regolazione per evitare danni ai tessuti sani • Sistemi di regolazione attivi e passivi – Passivi: estrema labilità di molti componenti che si inattivano subito – Attivi: vari regolaotri che inattivano i prodotti del compelmento • Deficit a carico del C 3 sono clinicamente più importanti; aumentano la suscettibilità alle infezioni batteriche

• La via lectinica è innescata dalla proteina legante il mannosio, che ha siti di legame per i carboidrati tipici della superficie batterica. • Una volta legata al batterio scatena una serie di reazioni enzimatiche attivano il COMPLEMENTO

• Gli anticorpi vengono prodotti da tre distinte famiglie geniche localizzate su cromosomi diversi: per le catene leggere K per le catene leggere l per le catene pesanti • Ogni famiglia genica contiene numerosi segmenti genici: • Regione variabile V e J nella catena leggera • Regione variabile V, D, J nella catena pesante • Regione costante Segmenti genici separati codificanti parti diverse delle regioni variabili delle catene leggere e delle catene pesanti vengono unite mediante fenomeni di ricombinazione nel corso del differenziamento della cellule B

V 1 V 2 V 3 Vn C J 1 J 2 J 3 J 4 DNA della linea germinale Regioni di DNA da unire V= circa 300 J=4 V 1 DNA della cellula B RICOMBINAZIONE SOMATICA CATENA LEGGERA V 2 C V 3 J 4 trascrizione splicing Sintesi delle catena leggera K nel topo: riarrangiamento V-J della catena leggera V 3 J 3 traduzione NH 2 C V 3 J 3 C COOH

Segmenti genici della catena pesante nel topo V 1 V 2 Vn D 1 D 2 Dn J 1 J 4 Cm Cd Cg Ce C Esistono almeno 100 -1000 segmenti genici V 12 segmenti D 4 segmenti J gruppo ordinato di segmenti C codificante una classe diversa di catene pesanti

• I riarrangiamenti avvengono in ordine sequenziale: prima quelli della catena pesante poi quelli della catena leggera • Sono finemente regolati, in modo tale che il DNA di un solo cromosoma parentale venga riarrangiato a formare un gene funzionale per la catena leggera o pesante. • Questa esclusione allelica assicura che Ab maturo abbia la specificità antigenica singola

Diversificazione combinatoria Uno dei circa 300 V si può unire a uno dei 4 J 300 x 4 = 1200 diverse regioni V (catena leggera) Uno dei 100 -1000 V si può unire a uno dei 20 D e dei 4 J: 1000 x 20 x 4 = 80. 000 diverse regioni V Una ulteriore diversità deriva dal fatto che gli eventi di giunzione sono imprecisi. Si può avere perdita di basi e cambiamneto di Frame

Regione V, D, J nella catena Pesante e Leggera k e l Segmenti Genici catena pesante V 51 D 27 J 6 Possibili Combinazioni 51 x 27 x 6=8262 C. leggera l 40 0 5 40 x 5=200 C. leggera k 30 0 4 30 x 4=120 Associazione Combinatoriale leggera-pesante 8262 x (200+120)= 2, 64 x 106

DIVERSITA’ GIUNZIONALE Una ulteriore diversità deriva dal fatto che gli eventi di giunzione sono imprecisi. Si può avere perdita di basi e cambiamneto di Frame V GAG GAT CCC ACA…. TAC CAC TGT GGA CGT TA… J GAG GAT CCG GTG GAC GTT A… GAG GAT CCG TGG ACG TT A GAG GAT CCT GGA CGT TA…. Cambia il Codice di lettura

• Nucleotidi P: aggiunta di nucletidi ad opera degli enzimi di riparazione • Nucelotidi N: aggiunta di di nucleotidi durante i processi di giunzione D-J e V-D-J mediante l’enzima terminal-trafesrasi • Ipermutazione somatica: sostituzione di singoli nucleotidi nelle unità V-J e V-D-J

Switch isotipico tra i geni delle catene pesanti • Il DNA della catena pesante può andare incontro a ulteriore riarrangiamneto in cui una unità V-D-J può combinarsi con uno dei segmenti C • Esempio: – V 2 -D 4 -J 3 può combinarsi con Cd oppure con Cg. . . L 1 VH 1 Ln VHn DH(1 -12) JH Cm Cd Cg 3 Cg 1 n=250 -1000 Cg 2 b Cg 2 a Ce C

Linfociti T e recettore (TCR)

Cellule T • Nascono nel midollo osseo e maturano nel timo • Durante la maturazione esprimono sulla membrana uno specifico recettore per l’Ag: recettore del linfocita T (T cell receptor TCR) • TCR riconosce Ag solo se è legato a proteine MHC, glicoproteine polimorfiche • Ci sono 2 sottopopolazioni di linfociti T: – T helper (TH) – T citotossiche (Tc)

• Il TCR riconosce solo Ag processati e associati a una molecola MHC espressa da una cellula APC o da una cellula bersaglio • Il DNA del TCR è organizzato in domini variabili codificati da diverse regioni geniche e costanti (come Ig) • Meccanismi di ricombinazione simili a quelli delle Ig • Cellule T presentano altre molecole accessorie di interazione con le APC (cellule che presentano l’antigene) – CD 40, CD 28, CTLA-4 • Il TCR è associato al CD 3, un complesso molecolare

Interazione APC e Linfocita T CTLA-4 B 7 (CD 80/86) CD 28 APC CD 58 (LFA-3) Attivazione CD 154 (CD 40 L) Attivazione Riconoscimento TCR MHC II Attivazione CD 2 CD 4+ Adesione T Cell CD 40

2 HN T NH 2 Ogni catena è lunga 280 aa. Omologia strutturale e di Sequenza con gli Ab Circa 100 geni V 50 geni J Circa 30 geni V Circa 12 geni J T Variabile V costante C V C membrana COOH Recettore cellue T

Memoria immunologica • Le risposte immunitarie acquisite danno luogo alla memoria immunologica di lunga durata e a una immunità protettiva • La risposta immunitaria primaria è sviluppata da un numero limitato di linfociti • L’intervallo necessario per la ooro espansione numerica fornisce al patogeno l’opportunità di avviare un processo infettivo fino alla comparsa della malattia • Il cloni della risposta primaria comprendono anche le cellule della memoria di lunga durata, che rendono la risposta più veloce e più intensa a una successiva esposizione allo stesso patogeno • L’intesità delle risposte secondarie può essere sufficiente a respingere la malattia

Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC)

• Tutte le specie di mammiferi possiedono un gruppo di geni strettamente associati, il complesso maggiore di Istocompatibilità (MHC), i cui prodotti proteici sono coinvolti nel riconoscimento cellulare e nelle discriminazione self e non-self. Svolge un ruolo fondamentale nel determinare se un tessuto trapiantato può essere accettato come self (istocompatibile) o rigettato (istoincompatibile) • MHC è fondamentale nello sviluppo delle risposte sia umorali che di tipo cellulare • I linfociti T riconoscono gli antigeni solo se associati a molecole MHC

• MHC è un gruppo di geni localizzato su un ampio tratto del Cromosoma 6 (uomo) e cromosoma 17 (topo) • Viene denominato HLA (human leukocytes antigen nell’uomo) • I geni sono localizzati in regioni che codificano 3 classi di proteine: geni MHC di classe I codificate nelle regioni A, B, C geni MHC di classe II codificati nelle regioni DP, DQ, DR geni MHC di classe III

Le molecole MHC espresse da un individuo non si modificano nel tempo e possono differire da quelle espresse da un altro individuo della stessa specie POLIMORFISMO MHC è uno dei complessi genetici più polimorfici dei vertebrati più evoluti e possiede un numero straordinariamente elevato di alleli diversi per ciascun locus Gli alleli differiscono del 5%-10% nella sequenza del DNA da un individuo all’altro

Proteine MHC sulle cellule che Presentano l’antigene

Antigen presenting cells (APC) • Le molecole MHC di classe I e classe II legano il peptide derivante dal processamento dell’Ag • Gli Ag di classe I si associano a molecole derivanti da antigeni endogeni • Gli Ag di classe II legano molecole derivate da antigeni esogeni • MHC di classe I sono su tutte le cellule (non specializzate) • MHC di classe II solo su cellule specializzate: – Linfociti B – Cellule dendritiche – Macrofagi – Fibroblasti, cellule gliali (cervello), cellule endoteliali, epiteliali, ecc.

LE MOLECOLE DI CLASSE I e II appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline Entrambe presentano l’antigene ai linfociti T Le molecole di classe I sono espresse in tutte le cellule nucleate che presentano gli antigeni endogeni processati ai linfociti CD 8+ Le molecole di classe II sono espresse solo in numero limitato di cellule presentanti l’antigene (macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B) che presentano gli Antigeni esogeni processati dai linfociti CD 4+

Restrizione immunitaria per le molecole MHC: I linfociti T citotossici CD 8 sono ristretti alla classe MHC I I linfociti TH CD 4 alle molecole di classe MHC II A seconda della provenienza dell’antigene, intracellulare (endogeno) o extracellulare (esogeno), il sistema immunitario viene attivato in modo diverso Antigeni esogeni: ciclo endocitico Antigeni endogeni: ciclo citosolico

Trasportatore associato alla processazione dell’Ag ubiquitina 7 ATP Ag esogeni complesso proteasoma peptidi Via citosoilica Ag esogeni Via endocitica TAP RE esopeptidasi Endocitosi/ fagocitosi compartimenti endocitari peptidi Complesso MHCI/peptide Aminoacidi semplici complesso MHCII/peptide

• MHC lega piccoli peptidi, 8 -10 amminoacidi • Ligandi Classe I circa 9 aa. • Ligandi Class 2 II tra 12 e 25 aa. • Un core di 9 amminoacidi è fondamentale per il legame tra peptide/MHC.

Human Tissue Typing for Transplants HLA Chromosome 6 D B C A Leukocyte MHC protein

• Ogni cellula del corpo è coperta di markers MHC-self, e ogni persona porta un set unico di questi markers. Se un linfocita T riconosce un struttura MHC non-self essa reagisce rapidamente per distruggerla. • • Per un trapianto di successo di un organo o di cellule staminali è necessari paragonare il set MHC del donatore e del ricevente. • Devono essere il più possibile simili. • Per trovare un buon “match” è necessario fare la tipizzazione tissutale dei linfociti. In questo caso i marker MHC-self sono chiamati HLA (human leukocytes antigens). Ogni cellula ha un doppio set di sei principali markers HLA, HLA-A, B e C e tre tipi di HLA-D.

Tipizzazione dell’HLA Gruppo di Alleli polimorfici trasmessiinsieme è definito APLOTIPO

SCHEMA GENERICO Complesso APC/MHC-pep/Cellula. T recettore Cellula T recettore Peptide estraneo Complesso peptide estraneo/recettore/ MHC (I o II) Cellula che presenta Ag CD 4/8 MHC Peptide estraneo

Come viene innescato l’intero sistema

Linfociti T helper: secernono citochine che favoriscono la risposta umorale e cellulomediata. Si attivano a contatto con uno specifico antigene presentato da una molecola MHC di classe II (sulla membrana di un macrofago o su un linfocita B). Allo stesso tempo si generano linfociti T di memoria a lunga vita. Le risposte combinate dei linfociti T helper, dei linfociti T citotossici e dei linfociti B controllano la specifica rimozione di antigeni dannosi e forniscono l’immunità permanente verso di essi. La risposta immunitaria cellulo-mediata si verifica quando i linfociti T citotossici riconoscono uno specifico antigene presentato da una molecola del complesso maggiore di istocompatibilità MHC di classe I sulla membrana di una cellula infettata da un virus o su una cellula tumorale. Si differenziano quindi in cellule (killer) assassine. I linfociti T citotossici rilasciano perforine ( formano dei pori nella membrana della cellula colpita) e frammentine (entrano nella cellula e determinano la sua morte, apoptosi). La risposta immunitaria umorale deriva dall’attivazione dei linfociti B. In seguito al contatto con specifici antigeni sulla membrana del batterio, i linfociti B proliferano e si differenziano in linfociti B di memoria a lunga vita e plasma-cellule a vita breve. Mentre i linfociti B di memoria sono responsabili dell’immunità permanente ad un antigene, le plasma-cellule secernono anticorpi che si uniscono ad un antigene bersaglio e quindi reclutano atri fattori di difesa (per esempio cellule fagocitarie) per distruggerlo.

Attivazione delle cellule T • L’attivazione di una cellula T citotossica o helper a proliferare e differenziarsi in cellula effettrice avviene per interazione con la cellula che presenta l’antigene, la quale deve trasmette alcuni segnali: – 1° segnale: peptide estraneo legato alla proteina MHC. – 2° segnale: proteine stimolatrici, come le proteine B 7 (CD 80 e CD 86) che sono riconosciute dal corecettore CD 28 sulle superficie della cellula T. Se le cellule T helper ricevono entrambi i segnali, si attivano, proliferano e secernono una citochina, chiamata interluchina-2. – 3° segnale: secrezione di interleuchine diverse Le cellule T helper assumono il comando della risposta immunitaria attivano tutte le altre cellule a proliferare

Attivazione di Cellule T da APC attivato IL-1 IL-6 IL-12 Recettore CD 28 “segnale 3” B 7 “Segnale 2” CD 4+ T cell Recettore Linf. T LPS TLR 4 “Segnale 1” Peptide MHC II Antigen Presenting Cell (APC) Signal 1: Specificità Signal 2: Attivazione Signal 3: Differenziamento

Cellule TH 1 e TH 2 • • Esistono due tipi di cellule T helper: TH 1 e TH 2. Questa distinzione è fatta sulla base delle citochine che secernono: • le cellule TH 1 secernono • le cellule TH 2 secernono – l’interferone g (IFN-g) – il fattore di necrosi tumorale (TNF-a) – aiutano essenzialmente i macrofagi, le cellule T citotossiche e -in parte- le cellule B; – le interleuchine 4, 5, 10 e 13 (Il-4, Il-5, IL-10 e IL-13) – stimolano le cellule B (solo quelle che presentano lo stesso antigene) a produrre anticorpi. La differenziazione delle cellule T in TH 1 e TH 2 influenza quindi il tipo di risposta immune che deve essere organizzata contro il patogeno. Una volta che TH 1 o TH 2 si sono sviluppate avviene una inibizione reciproca, cioè se si formano le TH 1, la produzione di (IFN-g) inibisce lo sviluppo di TH 2, mentre la produzione di IL-4 e IL-10 prodotte da TH 2 inibisce lo sviluppo di TH 1.

Attivazione da parte delle cellule Th 1 • Attivazione dei macrofagi. Le cellule TH 1 utilizzano due segnali per attivare i macrofagi: 1) la IFN-g 2) il ligando della proteina CD 40 si lega alla proteina CD 40 presente sulla superficie del macrofago. A questo punto i macrofagi attivati possono uccidere i patogeni contenuti nel fagosoma attraverso processi idrolitici, la formazione di radicali e ossido nitrico. • Attivazione delle cellule T citotossiche. Le cellule TH 1 attivano le cellule T citotossiche negli organi linfoidi periferici stimolando le cellule dendritiche a produrre proteine costimolatrici. Inoltre, la secrezione di IFN-g aumenta l’efficienza con cui le cellule bersaglio processano gli antigeni virali per presentarli alle cellule T citotossiche. • Attivazione delle cellule B. Le cellule TH 1 possono aiutare le cellule B a proliferare e differenziarsi sia in cellule secernenti anticorpi che cellule memoria. Inoltre stimolano anche il cambiamento di classe degli anticorpi.

Meccanismo di attivazione da parte delle cellule Th 2 • Il primo segnale è rappresentato dall’antigene che si lega al recettore-anticorpo legato alla membrana della cellula B. Processi di fosforilazione • Il secondo segnale è costituito dal ligando della proteina CD 40, che è espressa sulla superficie delle cellule. T attivate, ma non su quelle a riposo. L’interazione tra il ligando del CD 40 e il CD 40 è necessaria perché le cellule T attivino le cellule B a proliferare e a maturare in cellule della memoria e in cellule che secernono gli anticorpi. Nello stesso tempo viene prodotta interleuchina 4 (Il-4), che stimola la proliferazione e la maturazione delle cellule B

Attivazione dei macrofagi. IFN-g

• I meccanismi con cui le cellule T citotossiche uccidono le cellule bersaglio infettate sono due: – 1 - rilascio di una proteina, la perforina, in grado di formare pori sulla membrana della cellula infettata. Questa proteina, dapprima conservata in vescicole secretorie, viene rilasciata per esocitosi locale nel punto di contatto con la cellula bersaglio. Da queste vescicole sono rilasciate anche alcune proteasi, in particolare la granzyme B, che attiva alcune caspasi, innescando il processo apoptotico della cellula – 2 - Una proteina trimerica sulla superficie delle cellula T citotossica , si lega e attiva la proteina Fas sulla superficie della cellula bersaglio. La coda citosolica della Fas contiene un dominio che, quando è attivato, si lega a una proteina adattatrice e recluta la procaspasi-8. La successiva attivazione della caspasi 8 da inizio alla cascata proteolitica che porta al processo apoptotico.

Schema della risposta immunitaria Ingesione patogeni (Macrofagi) Digestione Patogeni Frammenti di antigeni proteici del Patogeno vengolo legati al MHC aulla membrana dei Macrofagi I Macrofagi presentano l’antigene ai Linfociti T Cellule T con recettori per l’antigene vengono sensibilizzate Cellule T sensibilizzate si dividono Cellule T helper Stimolano le cellule T esprimenti lo stesso recettore Cellule T Suppressor Cellule T citotossiche Distruggono l’antigene Inibiscono le Cellule B con lo stesso recettore antigenico

Cellule T helper Cellule T suppressor Stimolano le cellule T esprimenti lo stesso recettore Inibiscono le Cellule B aventi lo stesso recettore Termine della risposta immunitaria Divisione Cellule B Plasmacellule Cellule B di Memoria Cellule B producono Ab Anticorpi legano l’antigene Attivano il Complemento Aiutano I Fagociti a trovare gli antigeni Distruggono l’antigene