Dr Antonio Barbadilla Tema 10 Clonacin y secuenciacin

Dr. Antonio Barbadilla Tema 10: Clonación y secuenciación del DNA 1

Objetivos tema 10: Clonación y secuenciación del DNA Deberán quedar bien claros los siguientes puntos: • ¿Cómo se manipula el DNA? • Las endonucleasas (enzimas) de restricción • Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores • Vectores eucarióticos • Organismos transgénicos • Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto • Mapas de restricción • Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción • La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) • La secuenciación del DNA Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 2

Manipulación del DNA Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias. Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico Esta tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica Propiedad básica del DNA que permite su manipulación: El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación, . . . De fragmentos de DNA complementarios a uno dado Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 3

Herramienta básica Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato. • Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) • Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes 5´-GGATCC- 3´ 3´-CCTAGG- 5´ Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 4

Eco. RI: E. Coli Bam. HI: Bacillus amyloliquefaciens Dr. Antonio Barbadilla Dos tipos de cortes: • Corte plano: extremos romos • Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos Clonación y secuenciación del DNA 5

Herramienta básica Las enzimas de restricción tipo II: Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 6

Clonación del DNA • DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) • Vector de clonación (vehículo) Vector híbrido • Organismo huésped (E. Coli) • Selección de vectores Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 7

C Vectores l híbridos o (quimera) n a Fragmentos de distintas c procedencias que se unen in vitro i ó tras cortarse con la misma enzima n de restricción. d Ligasa sella zona e híbrida l Vectores de clonación D • Plásmido (1 sitio N de corte) 2 -15 kb A • Fago (Lambda) • Cósmido Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 8

C l o n a c i ó n d e l D N A Vectores de clonación Fago • Fago (2 sitios de corte) < 24 kb • Cromosomas artificiales P 1 (derivados del bacteriófago P 1, pueden aceptar insertos de 80 y 100 kb Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 9

C l o n a c i ó n d e l Vectores de clonación • Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb • BAC (cromosoma artificial bacteriano): derivado del plásmido F, insertos de 150 -300 kb. Usados en la secuencia de genomas Cósmido D N A Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 10

C l o n a c i ó n d e l Huésped: E. coli Inserción del vector híbrido en el huésped: • Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma • Fago (transducción, inserción en DNA huésped) • Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido) D N A Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 11

Selección de vectores híbridos C l o n a c i ó n d e l • Plásmido: resistencia a antibióticos D N A Dr. Antonio Barbadilla • Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo) Clonación y secuenciación del DNA 12

C l o n a c i ó n d e l D N A Obtención de la secuencia que se clona • Un gen • Aislamiento a partir del m. RNA (ya no tiene intrones): uso de la transcriptasa inversa que hace c. DNA (por ejemplo, 1982 primera insulina humana recombinante en bacterias) • Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100 bp • Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (aleotoria o perdigonada, Shotgun) • Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 13

Vectores eucarióticos Permite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas • Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura) Puede incorporar más de 500 kb de DNA Resistencia a antibiótico (p. e. , ampr) Origen de replicación del DNA de levadura (ARS) Región centromérica (CEN) Origen de replicación bacteriano (ori) Linealización (con endonucleasas) y adición de extremos teloméricos Telómero Dr. Antonio Barbadilla ampr ori CEN ARS Clonación y secuenciación del DNA Telómero 14

Transfección: Introducción de DNA foráneo en eucariotas Organismo transgénico: un eucariota con DNA foráneo Métodos transfección • Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente) • Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 15

Métodos transfección • Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 16

Métodos transfección • Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA • Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial) • Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA • Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens en plantas) y elementos móviles (Elemento P en Drosophila) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 17

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos Población de fragmentos Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 18

Separación fragmentos Reptación de los fragmentos a través del gel de agarosa Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 19

DNA teñido con bromuro de etidio emite fluorescencia con luz UV Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 20

Sondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes, . . . ), c. DNA suele usarse como sonda • Transferencia en Southern (Southern blotting) • Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 21

Transferencia en Southern (esquema resumen) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 22

Mapas de restricción mediante enzimas de restricción Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 23

Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 24

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 25

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• Secuenciación Usos de la PCR • DNA fósil (evolución, arqueología, historia) DNA traza Fósiles Mamut lanudo (40000 años) Abraham Lincoln (síndrome de Marfan, afecta tejido conectivo, fribrilina) Hombre Neandertal -> Hablaba como nosotros? Color cabello? • Huellas dactilares del DNA (DNA forense) Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 28

Secuenciación de DNA La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo de la estructura y función de un gen. • La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse • Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes • La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular • Secuenciación de genomas: estructura del genoma Disoxi Métodos: Secuenciación manual (inicial) Químico (Maxam y Gilbert 1977) Didesoxi (Sanger 1977) Dr. Antonio Barbadilla Secuenciación automatizada (1986, …) Clonación y secuenciación del DNA Didesoxi 29

Secuenciación del DNA Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 30

Secuenciación automatizada del DNA Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 31

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Animaciones de técnicas de la genética http: //www. dnalc. org/ddnalc/resources/animations. html Dr. Antonio Barbadilla Clonación y secuenciación del DNA 36