Lezione 8 Mutazioni 1 Mutazione Qualsiasi cambiamento PERMANENTE

Lezione 8 Mutazioni 1

Mutazione Qualsiasi cambiamento PERMANENTE nella sequenza nucleotidica del genoma di un organismo, o del suo materiale genetico extracromosomico (es. plasmidi, DNA mitocondriale) E’ un evento RARO La mutazione è CASUALE e genera delle innovazioni che possono essere utili o dannose 2

Mutazioni e selezione 1 Dal punto di vista selettivo una mutazione può risultare: Vantaggiosa l’organismo che la porta ha una fitness (capacità riproduttiva) maggiore Svantaggiosa l’organismo che la porta ha una fitness minore Neutra non influenza la fitness di chi la porta 3

Mutazioni e selezione 2 L’effetto delle mutazioni va sempre correlato all’ambiente in cui l’organismo si trova: una data mutazione può rivelarsi svantaggiosa (o neutra) in un dato ambiente, vantaggiosa in un altro 4

Varianti dell’emoglobina Esistono centinaia di diverse emoglobine mutanti in tutta la popolazione umana. Molte di queste forme mutanti sono dannose e danno origine a forme patologiche. Altre sono "neutre" e non sembra arrechino ai portatori ne’ vantaggi ne’ svantaggi. 5

Mutazioni e selezione 3 Mutazione anemia falciforme: sostituzione Glu-Val in catena b dell’emoglobina (emoglobina b. S) vantaggiosa o svantaggiosa? 6

Fenotipo degli omozigoti per la mutazione b. S (anemia falciforme) un gene mutato, molti sintomi Un’ unica sostituzione aminoacidica nell’emoglobina Dolore, ulcere alle gambe, danni a ossa, polmoni, reni, occhi, calcoli biliari, ittero, anemia, ritardo di crescita… Gli omozigoti SS hanno una fitness bassa a causa della grave malattia genetica; in omozigosi è svantaggiosa in qualsiasi ambiente. E in eterozigosi? 7

Mutazione b. S e malaria Dati OMS. Globalmente la malaria è ancora presente in 91 Paesi: il numero di casi annuali è stato stimato intorno ai 300 -500 milioni, con circa 1 -1, 5 milioni di decessi. La malaria esercita una formidabile pressione selettiva sulle popolazioni umane. Omozigote selvatico Wt/Wt (Glu/Glu) Portatore sano Wt/b. S (Glu/Val) Affetto b. S/b. S (Val/Val) neutro svantaggio Ambiente NON malarico leggero svantaggio leggero vantaggio svantaggio Ambiente malarico 8

Selezione a favore dell’eterozigote In ambiente non malarico i portatori (eterozigoti per la mutazione b. S) e gli omozigoti per l’allele selvatico hanno la stessa fitness. In zone malariche i portatori sono avvantaggiati rispetto agli omozigoti selvatici. Anopheles La resistenza alla malaria degli eterozigoti è dovuta al fatto che i globuli rossi degli individui wt/b. S non sono adatti allo sviluppo del Plasmodio (il protozoo parassita non riesce a trasportare sulla superficie del globulo rosso una proteina adesiva che lo proteggerebbe dal sistema immunitario dell’ospite). 9

Il vantaggio dell’eterozigote nelle regioni malariche * Alcune varianti alleliche del gene b dell’emoglobina (la variante b. S in Africa, le varianti b. Thal nel Mediterraneo) di per sé dannose in omozigosi, hanno frequenze elevate (fino al 30%) in regioni malariche (o ex malariche). * Questo perché l’eterozigote ha una minore probabilità di ammalarsi di malaria rispetto all’omozigote sano (che possiede due alleli b normali), quindi ha > probabilità di riprodursi trasmettendo i suoi geni (quindi anche l’allele S o b. Thal) alla progenie rispetto al wild type. In questo modo si mantiene alta la frequenza dell’allele mutato nella popolazione. 10

Distribuzione geografica di talassemia e malaria in Italia Le regioni d’Italia dove è presente la talassemia e le relative percentuali di diffusione tra la popolazione La malaria è diffusa in zone paludose. In Italia era molto diffusa, in passato, in varie zone costiere della Sardegna e in provincia di Ferrara, nella regione delta del Po. 11

Favismo * Deficit di Glucosio 6 -fosfato deidrogenasi (G 6 PD), enzima che produce sostanza antiossidante * Crisi emolitica scatenata da ingestione di fave (vicina) o farmaci (es. : chinino) o da contatto con alcune sostanze ossidanti (es. : naftalina, hennè, mentolo) poiché i globuli rossi risultano particolarmente sensibili a stress ossidativo * Diffusa in regioni malariche (Sardegna 14%, Sud est Asiatico 30%) per la minore suscettibilità dell’eterozigote all’infestazione da plasmodio * Fave con una mutazione in gene della vicina (ossidante) esprimono bassissime quantità di vicina e non scatenano crisi emolitiche nei soggetti fabici 12

Mutazioni germinali Per quanto riguarda la sede della mutazione è necessario distinguere: mutazioni germinali che colpiscono i gameti (es: mutazioni puntiformi in spermatogoni più frequenti in età avanzata) e possono essere trasmesse alla prole. L’individuo ha una mutazione solo nei gameti, mentre a livello somatico le sue cellule sono normali 13

Mutazioni somatiche mutazioni somatiche colpiscono le cellule somatiche e si esauriscono nell’individuo. La mutazione viene trasmessa attraverso la mitosi alla progenie della cellula colpita in origine = l’individuo sarà un mosaico. 14

Estensione della mutazione Può essere minima, riguardare cioè una singola o poche coppie di basi nel DNA MUTAZIONE PUNTIFORME oppure implicare regioni più estese dentro un gene (es delezione parziale o totale di un gene) MUTAZIONE GENICA fino anche a grosse porzioni del genoma MUTAZIONE CROMOSOMICA 15

Mutazioni cromosomiche 1 Anomalie di numero * Poliploidie: presenza di un numero di cromosomi corrispondente a un multiplo del corredo aploide (n) Tre o quattro copie di ciascun cromosoma * Aneuploidie: presenza di un cromosoma in più o in meno rispetto al corredo diploide (2 n+1, 2 n-1…). 16

Nelle piante è possibile indurre la poliploidia usando determinate sostanze chimiche colchicina Pianta 2 n Trattamento con colchicina Gameti diploidi Non disgiunzione meiotica Gameti diploidi Pianta 4 n 17

La poliploidia è comune nelle felci, nelle piante da fiore, nel frumento, sia in natura che nelle varietà selezionate dall’uomo La forma selvatica di frumento è diploide, e produce semi più piccoli 18

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Le banane che mangiamo tutti i giorni sono triploidi (3 n) * derivano dall’incrocio tra una banana 2 n (che produce gameti 1 n) e una 4 n (che produce gameti 2 n). 2 4 n 2 2 2 * Le banane 3 n non riescono a produrre gameti bilanciati e risultano sterili e prive di semi… 20

Vulnerabilità dei cloni * …vengono riprodotte dai coltivatori per talea, quindi sono tutte cloni! * La bassa variabilità genetica determina una elevata vulnerabilità ai patogeni. * In passato era diffusa la varietà Gros Michel, che venne spazzata via alla metà degli anni ‘ 50 dalla malattia di Panama (un’infezione fungina) * La varietà diffusa oggi è la Cavendish (il 40% della produzione mondiale) che resiste meglio alla malattia di Panama, ma… 21

Poliploidia negli animali La poliploidia è rara negli animali, in genere si osserva negli invertebrati. Nei mammiferi è sempre incompatibile con la vita 22

Mutazioni cromosomiche 2 Aneuploidia: presenza di cromosomi in più o in meno rispetto al corredo diploide (2 n+1, 2 n 1…). Conseguenza di errori di segregazione dei cromosomi durante la formazione dei gameti Dopo fecondazione con gamete normale si formerà embrione aneuploide fecondazione 2 n +1 2 n -1 23

Effetto aneuploidie 2 n - 1 omologhi 2 n 2 n + 1 omologhi Proteine codificate da geni presenti sul cromosoma Diminuisce o aumenta la quantità di m. RNA e quindi di proteine sintetizzate (vale per tutti i geni localizzati sul cromosoma interessato ) Sbilanciamento del dosaggio genico 24

Mutazioni puntiformi conseguenze (1) * Mutazioni puntiformi: riguardano una singola o poche coppie di basi nel DNA * Un’alta % del nostro genoma (<98% in h. sapiens) contiene regioni non codificanti (regioni intergeniche, introni. . . ) e una buona parte di queste non ha funzione. * Le mutazioni che riguardano queste regioni non hanno di solito alcuna particolare conseguenza sul fenotipo, sono quindi selettivamente neutre. 25

Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze intergeniche Gene 1 Gene 2 Gene 3 mutazione Le mutazioni che cadono in queste regioni molto probabilmente non hanno effetti sul fenotipo, e sono neutre dal punto di vista della selezione naturale, ma contribuiscono alla variabilità genetica tra individui diversi. 26

Queste mutazioni sono selettivamente neutre, determinano la variabilità genetica individuale Polimorfismi del DNA (SNP, STR…) Utilizzati per identificazione individuale in medicina forense, test di paternità… I polimorfismi rappresentano delle varianti fenotipicamente invisibili che possiamo utilizzare per marcare molecolarmente la variabilità fra individuo e individuo. 27

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Variazioni che riguardano il singolo nucleotide (2 alleli, 3 possibili genotipi) Alleli: G, A Genotipi: GG, AA 28

STR (Short Tandem Repeats) Sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di ripetizione molto corte (1 -5 bp). Per un determinato polimorfismo possono esistere numerosi alleli diversi (anche fino a 40), che differiscono tra loro per il numero di ripetizioni. Allele 1 2 3 Gli alleli differiscono per il numero delle ripetizioni GATA Sono moltissimi i genotipi possibili (es. : per un sistema a tre alleli ci sono 6 genotipi possibili: 11, 22, 33, 12, 23, 13) 29

Poiché il numero di alleli STR presenti nella popolazione è elevato, è molto probabile che individui diversi abbiano genotipi diversi a un locus (allele 1/allele 2) 7/8 8/9 4/8 3/5 5/9 8/8

Applicazioni in indagini forensi L’analisi contemporanea di tanti polimorfismi permette di identificare un singolo individuo in modo pressoché univoco polimorfismo A polimorfismo B Genotipo individuo sospetto 1 al locus A: A 2/A 4, al locus B: B 3/B 7 Genotipo individuo sospetto 2 al locus A: A 2/A 5, al locus B: B 4/B 4 Genotipo tracce biologiche sul luogo delitto: A 2/A 5 B 4/B 4 compatibili con l’individuo 2.

Applicazioni in indagini forensi Nelle indagini forensi è largamente utilizzata l’analisi delle impronte genetiche: * per identificare i sospettati di crimini * nei test di paternità * nell’identificazione di vittime delle catastrofi * nell’elaborazione di alberi genealogici * nella ricerca di persone scomparse * nelle indagini su personaggi storici (ad esempio, l’ultimo Zar di Russia e la sua famiglia) 32

Mutazioni intrageniche 1 promotore gene mutazione Una mutazione che cade in sequenze regolatrici potrebbe alterare il legame coi fattori di trascrizione, influendo sul livello di trascrizione + del gene (quantità di m. RNA) 33

Mutazioni intrageniche 2 Esone introne Esone splicing mutazione Mutazioni che avvengono nelle sequenze introniche di solito non hanno effetto sul fenotipo (gli introni non sono codificanti), a meno che non cadano in particolari sequenze localizzate ai confini tra esone e introne mutazioni di splicing 34

mutazione La mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing (GT/AG): l’eliminazione degli introni non avviene correttamente e la sequenza della proteina risulterà alterata 35

Mutazioni intrageniche 3 Esone introne Esone splicing mutazione Le mutazioni possono cadere nelle regioni codificanti (esoni) del gene 36

Mutazioni puntiformi conseguenze (2) Le mutazioni che riguardano porzioni codificanti di geni (ESONI) di solito hanno delle conseguenze fenotipiche perché possono comportare cambiamenti nella sequenza aminoacidica codificata. Es: SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI MUTAZIONE MISSENSO GAA GAT (glu-asp) MUTAZIONE NONSENSO GAG TAG (glu-stop) N. B. spesso però una mutazione riguardante la terza base di un codone non ne cambia il significato (ridondanza codice genetico): MUTAZIONE SINONIMA (NEUTRA): GAA GAG (glu-glu) 37

nonsenso GAG TAG (glu-stop) sinonima GAA GAG missenso GAA GAT (glu-asp) 38

Mutazione missenso: conseguenze sulla traduzione 39

Effetto di una mutazione missenso * La mutazione potrà inserire un aminoacido con le stesse caratteristiche chimiche (ingombro sterico, carica elettrica) di quello originario. In questo caso gli effetti sulla proteina saranno minimi. * La sostituzione con un aminoacido con caratteristiche chimiche diverse produrrà invece un cambiamento nella struttura della proteina e di conseguenza della sua funzione (es. mutazione 6 Glu>Val in bglobina) 40

Esempio di mutazione missenso 1 Anemia falciforme: mutazione missenso nel gene bglobina. L’acido glutammico in posizione 6 (carico negativamente) viene sostituito da valina (idrofobico) 41

Esempio di mutazione missenso 2 La valina in posizione 6 interagisce con una valina di un’ altra molecola di emoglobina, formando aggregati molecolari che precipitano nel globulo rosso 42

Mutazione nonsenso: conseguenze sulla traduzione Una mutazione nonsenso porterà alla sintesi di una proteina tronca 43

Mutazioni puntiformi conseguenze (3) Mutazioni in sequenze codificanti che comportano INSERZIONE/DELEZIONE di basi (in n° ≠ 3) causano slittamento della cornice di lettura e hanno sempre conseguenze fenotipiche svantaggiose: proteina diversa e terminazione prematura. Sono dette MUTAZIONI FRAMESHIFT 44

Mutazioni “frameshift” Viene alterato il modulo di lettura di tutti i codoni a valle dell’inserzione /delezione (frameshift) Delezione o inserzione di di 3 nt (o multipli di 3) non provoca frameshift. 45

Alleli al gruppo sanguigno AB 0 Catena H Gli alleli A e B codificano per due glicosiltransferasi con diversa specificità (rispettivamente per N-acetilgalattosammina o per Galattosio). L’allele 0 codifica per una forma inattiva di glicosiltransferasi, e quindi nessun altro zucchero viene legato alla catena H. 46

Esempio di mutazione frameshift: l’allele 0 Delezione di singolo nucleotide nell’ allele 0 del locus AB 0 provoca cambiamento del modulo di lettura dal codone 86 e terminazione prematura 30 aa dopo (STOP codon). La glicosiltransferasi codificata dall’allele 0 è inattiva. 47

Esempio di delezione di 3 nucleotidi Fibrosi Cistica, gene coinvolto CFTR (canale del cloro): la mutazione più frequente è delezione del codone Phe che porta alla sintesi di un polipeptide mancante di un aminoacido 48

Fibrosi cistica (CF) E’ la malattia autosomica recessiva più comune nella popolazione caucasica Circa un individuo su 25, in questa popolazione, è portatore sano di un allele recessivo del gene CFTR (codificante per proteina-canale del cloro) Gli individui affetti hanno due copie del gene CFTR mutato (la mutazione più frequente è delezione del codone Phe che porta alla sintesi di un polipeptide mancante di un aminoacido) Secrezioni mucose viscose: bronchite cronica, insufficienza pancreatica Sudorazione ad alto contenuto di sali (“morirà presto il bambino, la cui fronte sa di sale se baciata” antico proverbio tedesco del XVII° secolo) 49

Vantaggio dell’eterozigote Come spiegare una così alta frequenza di alleli non funzionanti di CFTR nella popolazione? Ipotesi del vantaggio selettivo dell’eterozigote: ci sono casi in cui l'eterozigote ha un fenotipo intermedio o diverso dai due omozigoti, che conferisce un vantaggio in termini riproduttivi su questi ultimi. È stato ipotizzato che l’eterozigote manifesti una maggior resistenza rispetto all’omozigote wilde type nei confronti di tossine batteriche provocano diarrea (colera) oppure sarebbe più resistente all’attacco della mucosa intestinale da parte di determinati patogeni (tifo). La pressione selettiva operata in passato da questi patogeni avrebbe mantenuto alta la frequenza degli alleli mutati di CFTR nella popolazione 50

Mutazioni: cause SPONTANEA Insorge in assenza di agenti mutageni esterni ed è prodotta da errori nei processi di ricombinazione, replicazione e/o riparazione del DNA INDOTTA Da agenti mutageni chimici o fisici 51

Mutazione da errore di replicazione Il processo di replicazione del DNA rappresenta la principale fonte di mutazioni. Tutti gli organismi possiedono due meccanismi fondamentali di salvaguardia della fedeltà dell’informazione molecolare: * Correzione di bozze (corregge gli errori di appaiamento commessi dalla DNA polimerasi mentre la replicazione è in corso) C G T GAACTG GCACTT. . . C G T GAACTG GCAT T * Riparazione degli appaiamenti errati dopo replicazione del DNA 52

Mutazioni indotte da agenti mutageni Il tasso naturale di mutazione del DNA viene incrementato dall’interazione ambientale con agenti chimici e fisici o biologici MUTAGENI - chimici - fisici - biologici 53

Mutageni chimici 1 Esistono varie sostanze chimiche interagiscono con il DNA modificando e/o danneggiando le basi azotate e causano appaiamenti errati 54

Mutageni chimici 2 I mutageni chimici possono causare sostituzioni di nucleotidi Esempio: aflatossina B 1. Micotossina presente in alcune muffe. In condizioni ambientali favorevoli le spore degli Aspergillus germinano e successivamente colonizzano svariate tipologie di alimenti, quali mais, arachidi ed altri semi oleosi. Metabolizzate da enzimi nel fegato vengono modificate (Promutageno Mutageno) Formano addotti con il DNA mutazioni carcinoma epatico Un derivato della aflatossina B 1, la Afl M 1, viene secreta nel latte contaminazione di prodotti caseari Le aflatossine sono tra le sostanze più cancerogene esistenti. 55

Mutageni chimici 3 I mutageni chimici possono causare inserzioni o delezioni di nucleotide Esempio: benzopirene nel fumo di sigaretta, nello scarico dei motori Diesel, nella carbonizzazione dei cibi… 56

Fumo, cancro e riparazione del DNA * La capacità di riparare i danni al DNA arrecati dal fumo (ossidazione delle guanine) dipende dall’ enzima OGG (8 -oxoguanine DNA N-glycosylase). * Esiste una variabilità individuale nel livello di attività dell’enzima. * La variante allelica 326 Ser del gene OGG 1 ha un’attività enzimatica maggiore della variante 326 Cys. * I fumatori non hanno tutti lo stesso rischio di cancro: chi ha bassa attività di OGG ha un rischio decisamente maggiore (30 -120 volte) di chi, a parità di n° sigarette fumate, ha naturalmente alti livelli di OGG. Il danno finale è il risultato di due fattori di rischio indipendenti: Il fumo + la ridotta capacità di riparare le guanine modificate

Mutageni fisici * Radiazioni UV a bassa energia, poco penetranti * Radiazionizzanti (raggi X, raggi a, b, g), ad alta energia, altamente penetranti hanno energia sufficiente per produrre ionizzazione (rottura dei legami atomici che tengono insieme le molecole e creazione di particelle cariche→ioni) 58

Meccanismo di mutagenicità UV * Il danno è localizzato a livello superficiale (pelle) perché hanno bassa energia * Inducono la formazione di dimeri di timina (formazione di legame covalente tra due T adiacenti sullo stesso filamento) * Per ogni secondo di esposizione al sole si producono 50 -100 dimeri in ogni cellula della pelle di cui il 2% cadono in coding sequences 59

Riparazione del danno indotto da da UV 60

Meccanismo di mutagenicità radiazionizzanti * A causa della loro alta energia hanno un forte potere penetrante * Trasferiscono energia alle molecole biologiche con cui collidono (DNA, lipidi, proteine) modificandole e danneggiandole 61

Danni al DNA da radiazionizzanti a) Rottura di singolo filamento (più semplice da riparare) b) Rottura del doppio filamento (una riparazione errata può generare danni: rotture, traslocazioni…) a b Cromosomi non omologhi c traslocazione d c) Modificazione chimica delle basi (provoca sostituzione di base) d) Rimozione di singole basi (provoca sostituzione di base) 62

Ciò che noi sappiamo sugli effetti biologici delle radiazionizzanti deriva da: * Esperimenti di irradiazione “in vitro” (cellule in coltura, animali di laboratorio, etc) * Esposizione per motivi professionali (1920 -1950, prevenzione non sufficiente) * Esplosioni bombe atomiche (Hiroshima e Nagasaki, 1945) * Incidenti centrali nucleari (Three Miles Island, USA 1979; Chernobyl, Ucraina 1986; Fukushima, Giappone 2011) 63

Azione mutagena dei raggi X su drosophila Nel 1927 Hermann J. Muller dimostrò che irradiando le drosofile con raggi X si aumentava enormemente la frequenza di mutazione dei geni nei discendenti. Inoltre, Muller fu in grado di dimostrare che esisteva una proporzionalità diretta tra la dose di raggi X e il numero di mutazioni. 64

Erano gli inizi del 1900, Pierre e Marie Curie avevano appena scoperto polonio e radio, e nel giro di pochi anni si erano diffusi prodotti di bellezza, farmaci e cure a base di radio che promettevano risultati quasi miracolosi. Il successo fu immediato. Tra il 1940 e i '50, l'americana Gilbert Company ha prodotto il più completo set al mondo dell'Atomic Energy Lab, versione "nucleare" del "piccolo chimico". Tho-Radia La crema viso era particolarmente popolare, la sua formulazione era la seguente: 0, 5 g di Cloruro di Torio e 0. 25 mg Bromuro di Radio per 100 g di prodotto.

The radium girls “Undark”, una vernice contenente Radio, che dava luminescenza verde al buio. Usata tra il 1917 e il 1938 per dipingere le ore e le lancette degli orologi dalla US Radium Corporation, la quale era a conoscenza della pericolosità del prodotto, ma non fece nulla per proteggere le sue operaie. 66

L’incidente di Chernobyl (26. 4. 1986) 4230 i morti a breve dall’esplosione 7 milioni i 67 contaminati, di cui 3 milioni bambini

Mutageni biologici Virus: alcuni virus integrandosi nel genoma dell’ospite in prossimità di geni coinvolti nella replicazione cellulare ne alterano il funzionamento Gene che regola la replicazione cellulare Batteri: Helicobacter Pylori induce infiammazione cronica con produzione di prodotti ossidanti che vanno a danneggiare il DNA aumentando il tasso di mutazione 68