Lezione 8 Mutazioni 1 Mutazione Qualsiasi cambiamento PERMANENTE

Lezione 8 Mutazioni 1

Mutazione Qualsiasi cambiamento PERMANENTE nella sequenza nucleotidica del genoma di un organismo, o del suo materiale genetico extracromosomico (es. plasmidi, DNA mitocondriale) E’ un evento RARO La mutazione è CASUALE e genera delle innovazioni che possono essere utili o dannose 2

Mutazioni e selezione 1 Dal punto di vista selettivo una mutazione può risultare: Vantaggiosa l’organismo che la porta ha una fitness (capacità riproduttiva) maggiore Svantaggiosa l’organismo che la porta ha una fitness minore Neutra non influenza la fitness di chi la porta 3

Mutazioni e selezione 2 L’effetto delle mutazioni va sempre correlato all’ambiente in cui l’organismo si trova: una data mutazione può rivelarsi svantaggiosa (o neutra) in un dato ambiente, vantaggiosa in un altro 4

Varianti dell’emoglobina Esistono centinaia di diverse emoglobine mutanti in tutta la popolazione umana. Molte di queste forme mutanti sono dannose e danno origine a forme patologiche. Altre sono "neutre" e non sembra arrechino ai portatori ne’ vantaggi ne’ svantaggi. 5

Mutazioni e selezione 3 Mutazione anemia falciforme: sostituzione Glu-Val in catena b dell’emoglobina (emoglobina b. S) vantaggiosa o svantaggiosa? 6

Fenotipo degli omozigoti per la mutazione b. S (anemia falciforme) un gene mutato, molti sintomi Un unica sostituzione aminoacidica nell’emoglobina Dolore, ulcere alle gambe, danni a ossa, polmoni, reni, occhi, calcoli biliari, ittero, anemia, ritardo di crescita… Gli omozigoti SS hanno una fitness bassa a causa della grave malattia genetica; in omozigosi è sicuramente svantaggiosa in qualsiasi 7 ambiente.

Mutazione b. S e malaria L’Oms riporta i dati relativi alla malaria nel mondo nel 2016. Globalmente la malaria è ancora presente in 91 Paesi: il numero di casi totali è stato stimato intorno ai 216 milioni, con circa 445 mila decessi. Omozigote selvatico Wt/Wt (Glu/Glu) Portatore sano Wt/b. S (Glu/Val) Affetto b. S/b. S (Val/Val) neutro svantaggio Ambiente NON malarico leggero svantaggio leggero vantaggio svantaggio Ambiente malarico 8

Selezione a favore dell’eterozigote In ambiente non malarico i portatori (eterozigoti per la mutazione b. S) e gli omozigoti per l’allele selvatico hanno la stessa fitness. In zone malariche i portatori sono avvantaggiati rispetto agli omozigoti selvatici. La resistenza alla malaria degli eterozigoti è dovuta al fatto che i globuli rossi degli individui wt/b. S non sono adatti allo sviluppo del Plasmodio (il parassita non riesce a trasportare le sue proteine sulla superficie del globulo rosso).

Il vantaggio dell’eterozigote nelle regioni malariche * Alcune varianti alleliche del gene b (la variante b. S in Africa, le varianti b. Thal nel Mediterraneo) di per sé dannose, hanno frequenze elevate in regioni malariche (o ex malariche). * L’alta frequenza (fino al 30%) dell’allele S o dell’allele b. Thal nelle regioni malariche è dovuta al fatto che l’eterozigote, a differenza dell’omozigote sano (che possiede due alleli b normali), non si ammala di malaria quindi ha > probabilità di riprodursi trasmettendo i suoi geni (quindi anche l’allele S o b. Thal) alla progenie rispetto al wild type. 10

Distribuzione geografica di talassemia e malaria in Italia La malaria è diffusa in zone paludose. In Italia era molto diffusa, in passato, in varie zone costiere della Sardegna e in provincia di Ferrara, nella regione delta del Po. Le regioni d’Italia dove è presente la talassemia e le percentuali di diffusione tra la popolazione 11

Mutazioni germinali Per quanto riguarda la sede della mutazione è necessario distinguere: mutazioni germinali che colpiscono i gameti e possono essere trasmesse alla prole. L’individuo ha una mutazione solo nei gameti, mentre a livello somatico le sue cellule sono normali 12

Mutazioni somatiche mutazioni somatiche colpiscono le cellule somatiche e si esauriscono nell’individuo. La mutazione viene trasmessa attraverso la mitosi alla progenie della cellula colpita in origine = l’individuo sarà un mosaico 13

Mosaicismo somatico e inattivazione cromosoma X * Nel gatto uno dei geni che controlla la colorazione del pelo (con varianti alleliche arancione/nero) è localizzato sul cromosoma X. * I maschi possiedono solo un cromosoma X per cui saranno neri o arancioni. * Le femmine omozigoti per il colore arancione saranno arancioni, le omozigoti per il nero saranno nere. * Ma quale sarà l’aspetto fenotipico delle eterozigoti? ? 14

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La stragrande maggioranza dei gatti calico o tartaruga sono femmine. Ma esistono anche rari casi di maschi con questa colorazione del mantello. Questi maschi hanno una trisomia dei cromosomi sessuali (XXY, vedi sindrome di Klinefelter umana) 16

Estensione della mutazione Può essere minima, riguardare cioè una singola o poche coppie di basi nel DNA MUTAZIONE PUNTIFORME oppure implicare regioni piu’estese dentro un gene (es delezione parziale o totale di un gene) MUTAZIONE GENICA fino anche a grosse porzioni del genoma MUTAZIONE CROMOSOMICA 17

Mutazioni cromosomiche - anomalie di numero POLIPLOIDIE ANEUPLOIDIE 18

Poliploidia 1 Presenza di un numero di cromosomi corrispondente a un multiplo del corredo aploide (n) 19

Poliploidia 2 Conseguenza di anomalie nella fecondazione La triploidia origina da un difetto di fertilizzazione * uovo aploide fecondato da due spermatozoi aploidi * fecondazione tra gamete diploide e gamete aploide 20

Nelle piante è possibile indurre la poliploidia usando determinate sostanze chimiche colchicina Pianta 2 n Trattamento con colchicina Gameti diploidi Non disgiunzione meiotica Gameti diploidi Pianta 4 n 21

La poliploidia è comune nelle felci, nelle piante da fiore, nel frumento, sia in natura che nelle varietà selezionate dall’uomo 22

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Le banane che mangiamo tutti i giorni sono triploidi (3 N) * derivano dall’incrocio tra una banana 2 N (che produce gameti 1 N) e una 4 N (che produce gameti 2 N). 2 4 n 2 2 2 * Le banane 3 N non riescono a produrre gameti bilanciati e risultano sterili e prive di semi… 24

Vulnerabilità dei cloni * …vengono riprodotte dai coltivatori per talea, quindi sono tutte cloni! * La bassa variabilità genetica determina una elevata vulnerabilità ai patogeni. * In passato era diffusa la varietà Gros Michel, che venne spazzata via alla metà degli anni ‘ 50 dalla malattia di Panama (un’infezione fungina) * La varietà diffusa oggi è la Cavendish (il 40% della produzione mondiale) che resiste meglio alla malattia di Panama, ma… 25

Poliploidia negli animali La poliploidia è rara negli animali, in genere si osserva negli invertebrati. Nei mammiferi è sempre incompatibile con la vita 26

Aneuploidia: presenza di cromosomi in più o in meno rispetto al corredo diploide (2 n+1, 2 n-1…). Conseguenza di errori di segregazione dei cromosomi durante la formazione dei gameti 27

Dopo fecondazione con gamete normale si formeranno embrioni 2 n+1 2 n-1 2 n 28 2 n+1 2 n-1

Effetto aneuploidie 2 n - 1 omologhi 2 n 2 n + 1 omologhi Proteine codificate da geni presenti sul cromosoma Diminuisce o aumenta la quantità di m. RNA e quindi di proteine sintetizzate (vale per tutti i geni localizzati sul cromosoma interessato ) Sbilanciamento del dosaggio genico

Mutazioni cromosomiche - anomalie di struttura conseguenza di rotture cromosomiche 30

Mutazione Può essere minima, riguardare cioè una singola o poche coppie di basi nel DNA MUTAZIONE PUNTIFORME 31

Mutazioni conseguenze (1) Un’alta % del nostro genoma contiene regioni non codificanti (regioni intergeniche, introni. . . ) e una buona parte di queste non ha funzione. Le mutazioni che riguardano queste regioni non hanno di solito alcuna particolare conseguenza sul fenotipo, sono quindi selettivamente neutre. 32

Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze intergeniche Gene 1 Gene 2 Gene 3 mutazione 33

Queste mutazioni sono selettivamente neutre, determinano la variabilità genetica individuale Polimorfismi del DNA (SNP, STR…) Identificazione individuale (medicina forense, test di paternità…) I polimorfismi rappresentano delle varianti fenotipicamente invisibili che possiamo utilizzare per marcare molecolarmente la variabilità fra individuo e individuo. 34

SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Variazioni che riguardano il singolo nucleotide (2 alleli) 35

STR (Short Tandem Repeats) Sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di ripetizione molto corte (1 -5 bp). Per un determinato polimorfismo possono esistere numerosi alleli diversi, che differiscono tra loro per il numero di ripetizioni Allele 1 2 3 Gli alleli differiscono per il numero delle ripetizioni GATA 36

Poiché il numero di alleli STR presenti nella popolazione è elevato, è molto probabile che individui diversi abbiano genotipi diversi (allele 1/allele 2) 4/8 7/8 8/9 5/9 6/8 8/8

Applicazioni in medicina legale L’analisi contemporanea di tanti polimorfismi permette di identificare un singolo individuo in modo pressoché univoco polimorfismo A polimorfismo B Genotipo individuo sospetto 1 al locus A: A 2/A 4, al locus B: B 3/B 7 Genotipo individuo sospetto 2 al locus A: A 2/A 5, al locus B: B 4/B 4 Genotipo tracce biologiche sul luogo delitto: A 2/A 5 B 4/B 4 compatibili con l’individuo 2.

Applicazioni in medicina legale Nelle indagini forensi è largamente utilizzata l’analisi delle impronte genetiche: * per identificare i sospettati di crimini * nei test di paternità * nell’identificazione di vittime delle catastrofi * nell’elaborazione di alberi genealogici * nella ricerca di persone scomparse * nelle indagini su personaggi storici (ad esempio, l’ultimo Zar di Russia e la sua famiglia) 39

Mutazioni intrageniche 1 promotore gene mutazione Una mutazione che cade in sequenze regolatrici potrebbe alterare il legame coi fattori di trascrizione, influendo sul livello di trascrizione del gene (quantità di m. RNA) 40

Mutazioni intrageniche 2 Esone introne Esone splicing mutazione Mutazioni che avvengono nelle sequenze introniche di solito non hanno effetto sul fenotipo, a meno che non cadano in particolari sequenze localizzate ai confini tra esone e introne mutazioni di splicing 41

mutazione La mutazione colpisce una sequenza consenso dello splicing (GT/AG): l’eliminazione degli introni non può avvenire correttamente e la sequenza della proteina risulterà alterata 42

Mutazioni intrageniche 3 Esone introne Esone splicing mutazione 43 introne Esone

Mutazioni conseguenze (2) Le mutazioni che riguardano porzioni codificanti di geni (ESONI) di solito hanno delle conseguenze fenotipiche perché possono comportare cambiamenti nella sequenza aminoacidica codificata. Es: SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI MUTAZIONE MISSENSO GAA GAT (glu-asp) MUTAZIONE NONSENSO GAG TAG (glu-stop) N. B. spesso però una mutazione riguardante la terza base di un codone non ne cambia il significato (ridondanza codice genetico): MUTAZIONE SINONIMA (NEUTRA): GAA GAG (glu-glu) 44

nonsenso GAG TAG (glu-stop) sinonima GAA GAG missenso GAA GAT (glu-asp) 45

Mutazione missenso: conseguenze sulla traduzione 46

Effetto di una mutazione missenso * La mutazione potrà inserire un aminoacido con le stesse caratteristiche chimiche (ingombro sterico, carica elettrica) di quello originario. In questo caso gli effetti sulla proteina saranno minimi. * La sostituzione con un aminoacido con caratteristiche chimiche diverse produrrà invece un cambiamento nella struttura della proteina e di conseguenza della sua funzione (es. mutazione 6 Glu>Val in b-globina) 47

Esempio di mutazione missenso Anemia falciforme: mutazione missenso nel gene bglobina. L’acido glutammico in posizione 6 (carico negativamente) viene sostituito da valina (idrofobico) 48

Esempio di mutazione missenso La valina in posizione 6 interagisce con una valina di un’ altra molecola di emoglobina, formando aggregati molecolari che precipitano nel globulo rosso 49

Mutazione nonsenso: conseguenze sulla traduzione Una mutazione nonsenso porterà alla sintesi di una proteina tronca 50

Mutazioni conseguenze (3) Mutazioni in sequenze codificanti che comportano INSERZIONE/DELEZIONE di basi (in n° ≠ 3) causano slittamento della cornice di lettura e hanno sempre conseguenze fenotipiche (di solito svantaggiose): proteina diversa e terminazione prematura. Sono dette MUTAZIONI FRAMESHIFT 51

Mutazioni “frameshift” Viene alterata la lettura di tutti i codoni a valle dell’inserzione /delezione Delezione o inserzione di di 3 nt (o multipli di 3) non provoca frameshift 52

Alleli al gruppo sanguigno AB 0 Gli alleli A e B codificano per due glicosiltransferasi con diversa specificità. L’allele 0 codifica per una forma inattiva di glicosiltransferasi 53

L’allele 0 ha una mutazione frameshift Delezione di singolo nucleotide nell’ allele 0 del locus AB 0 provoca cambiamento del modulo di lettura dal codone 86 e terminazione prematura 30 aa dopo (STOP codon). La glicosiltransferasi codificata dall’allele 0 è inattiva. 54

Esempio di delezione di 3 nucleotidi Fibrosi Cistica, gene coinvolto CFTR (canale del cloro): la mutazione più frequente è delezione di un codone che porta alla sintesi di un polipeptide mancante di un aminoacido 55

Mutazioni: cause SPONTANEA insorge in assenza di agenti mutageni esterni ed è prodotta da errori nei processi di ricombinazione, replicazione e/o riparazione del DNA INDOTTA da agenti mutageni chimici o fisici 56

Mutazione da errore di replicazione Il processo di replicazione del DNA rappresenta la principale fonte di mutazioni. Tutti gli organismi possiedono due meccanismi fondamentali di salvaguardia della fedeltà dell’informazione molecolare: * Correzione di bozze (corregge gli errori di appaiamento commessi dalla DNA polimerasi mentre la replicazione è in corso) C G T GAACTG GCACTT. . . C G T GAACTG GCAT T * Riparazione degli appaiamenti errati dopo replicazione del DNA 57

Mutazioni indotte da agenti mutageni Il tasso naturale di mutazione del DNA viene incrementato dall’interazione ambientale con agenti chimici e fisici MUTAGENI 58

Mutageni chimici 1 Esistono varie sostanze chimiche interagiscono con il DNA modificando e/o danneggiando le basi azotate e causano appaiamenti errati 59

Mutageni chimici 2 I mutageni chimici possono causare sostituzioni di nucleotidi Esempio: aflatossina B 1. Micotossina presente in alcune muffe. In condizioni ambientali favorevoli le spore degli Aspergillus germinano e successivamente colonizzano svariate tipologie di alimenti, quali mais, arachidi ed altri semi oleosi. Le aflatossine sono tra le sostanze più cancerogene esistenti. 60

Mutageni chimici 3 I mutageni chimici possono causare inserzioni o delezioni di nucleotide Esempio: benzopirene nel fumo di sigaretta, nello scarico dei motori Diesel, nella carbonizzazione dei cibi… 61

Fumo, cancro e riparazione del DNA La capacità di riparare i danni al DNA arrecati dal fumo (ossidazione delle guanine) dipende dall’ enzima OGG (8 -oxoguanine DNA N-glycosylase). Esiste una variabilità individuale nella produzione dell’enzima. La variante allelica 326 Ser del gene OGG 1 ha un’attività enzimatica maggiore della variante 326 Cys. I fumatori non hanno tutti lo stesso rischio di cancro: chi ha bassa attività di OGG ha un rischio decisamente maggiore (30 -120 volte) di chi, a parità di n° sigarette fumate, ha naturalmente alti livelli di OGG. Il danno finale è il risultato di due fattori di rischio indipendenti: Il fumo + la ridotta capacità di riparare le guanine modificate

Mutageni fisici * Radiazioni UV a bassa energia, poco penetranti * Radiazionizzanti (raggi X, raggi a, b, g), ad alta energia, altamente penetranti 63

Meccanismo di mutagenicità UV * Il danno è localizzato a livello superficiale (pelle) * Inducono la formazione di dimeri di timina (formazione di legame covalente tra due T adiacenti sullo stesso filamento) * Per ogni secondo di esposizione al sole si producono 50 -100 dimeri in ogni cellula della pelle di cui il 2% cadono in coding sequences 64

Riparazione del danno indotto da da UV 65

I processi di riparazione del DNA post replicativi sono ESSENZIALI 66

Meccanismo di mutagenicità radiazionizzanti * A causa della loro alta energia hanno un forte potere penetrante * Trasferiscono energia alle molecole biologiche con cui collidono (DNA, lipidi, proteine) modificandole e danneggiandole 67

Danni al DNA da radiazionizzanti a) Rottura di singolo filamento a b) Rottura del doppio filamento b c) Modificazione chimica delle basi c d d) Rimozione di singole basi 68

Ciò che noi sappiamo sugli effetti biologici delle radiazionizzanti deriva da: * esperimenti di irradiazione “in vitro” (cellule in coltura, animali di laboratorio, etc) * esposizione per motivi professionali (1920 -1950, prevenzione non sufficiente) * esplosioni bombe atomiche (Hiroshima e Nagasaki, 1945) * incidenti centrali nucleari (Three Miles Island, USA 1979; Chernobyl, Ucraina 1986; Fukushima, Giappone 2011) 69

Azione mutagena dei raggi X su drosophila Nel 1927 Hermann J. Muller dimostrò che irradiando le drosofile con raggi X si aumentava enormemente la frequenza di mutazione dei geni nei discendenti. Inoltre, Muller fu in grado di dimostrare che esisteva una proporzionalità diretta tra la dose di raggi X e il numero di mutazioni. 70

Erano gli inizi del 1900, Pierre e Marie Curie avevano appena scoperto la radioattività e nel giro di pochi anni si erano diffusi prodotti di bellezza, farmaci e cure a base di radio che promettevano risultati quasi miracolosi. Il successo fu immediato. Tra il 1940 e i '50, l'americana Gilbert Company ha prodotto il più completo set al mondo dell'Atomic Energy Lab, versione "nucleare" del "piccolo chimico". Tho-Radia La crema viso era particolarmente popolare, la sua formulazione era la seguente: 0, 5 g di Cloruro di Torio e 0. 25 mg Bromuro di Radio per 100 g di prodotto.

L’incidente di Chernobyl (26. 4. 1986) 4230 i morti a breve dall’esplosione 7 milioni i 72 contaminati, di cui 3 milioni bambini

Cancro alla tiroide dopo Chernobyl (1986) 73

Modalità esame * Scritto * 30 domande a risposta multipla (sul sito è pubblicato un compito come esempio) * 2 appelli (è possibile iscriversi anche al secondo se non si supera il primo, o se si vuole migliorare il voto) 74