Identificazione e studio delle mutazioni Le mutazioni La

Identificazione e studio delle mutazioni

Le mutazioni

La mutazione è un evento che altera la funzionalità dei geni e dei loro prodotti Il bersaglio molecolare principale dell’evento mutazionale è il gene (la sequenza nucleotidica) Gli effetti si riflettono sull’espressione del gene a livello di trascrizione e traduzione Il risultato può essere 1) Prodotto genico assente 2) Prodotto genico ridotto 3) Prodotto genico presente, ma non funzionale, 4) Prodotto genico con funzione aberrante 5) Prodotto genico espresso in eccesso o ectopicamente (ovvero in tessuti dove normalmente non è presente)

Effetti delle mutazioni e loro utilizzo • Alterano la funzione del gene • Sono fonte di variabilità genetica presente nelle popolazioni, necessaria per l’evoluzione delle specie • Sono alla base dell’analisi genetica che ha permette di isolare i geni coinvolti nella formazione di un fenotipo o di un processo biologico complesso (sviluppo, differenziamento, mitosi, meiosi) • Analisi dei vari meccanismi di mutagenesi

Mutazione somatica e mutazione germinale Le mutazioni somatiche non sono trasmesse alle generazioni successive Mutazione somatica e cancro Le mutazioni della linea germinale sono trasmesse alle generazioni successive attraverso i gameti e nella specie umana possono causare malattie genetiche Sono la fonte della variabilità genetica delle popolazioni

Mutazione e retromutazione in avanti: cambiamento che genera un allele diverso (mutante) da quello selvatico retromutazione o reversione: cambiamento che riporta l’allele mutante alla condizione di tipo selvatico

Classificazione delle mutazioni a seconda dei diversi livelli fenotipici • mutazioni morfologiche • mutazioni letali • mutazioni condizionali • mutazioni biochimiche • mutazioni di resistenza

Mutazioni morfologiche Alterano le caratteristiche esteriori di un organismo come la forma, il colore, le dimensioni.

Mutazioni morfologiche

Mutazioni nel gene della miostatina Super Mucca“, “Monster Cow“, sono solo alcuni dei soprannomi della razza bovina Belgian Blue. LA MIOSTATINA è una proteina prodotta dalle cellule del muscolo scheletrico nel corso dello sviluppo e durante la vita adulta. Essa agisce come regolatore negativo della crescita muscolare. L’assenza di miostatina causa un aumento della massa muscolare

Mutazioni letali nella specie umana * In generale sono letali tutti quegli alleli che causano l’espressione anomala di un gene alterando il differenziamento e lo sviluppo e causano la morte in utero o danno luogo alla nascita di individui gravemente malformati * Ad esempio, sono letali recessivi in omozigosi gli alleli che causano la talassemia e l’anemia falciforme, oppure quelli che in eterozigosi hanno anche effetti dominanti come nel caso del nanismo acondroplasico (effetti pleiotropici)

Mutazioni letali nel topo Y Y A/A A Y allele letale recessivo nel topo X Y Y A/A L’embrione non si sviluppa Mutazioni morfologiche Y A/A rapporto di sopravvivenza 2 gialli: 1 selvatico Y A/A

Mutazioni condizionali Un mutante condizionale presenta il fenotipo alterato solo in determinate condizioni ambientali (condizione restrittiva), mentre presenta il fenotipo selvatico in un ambiente diverso (condizione permissiva) + La mutazione Curly (Cy) è termosensibile Gli eterozigoti Cy/Cy mostrano il fenotipo ali curve verso l’alto a 25 gradi, mentre a 18 il fenotipo è identico a quello selvatico La mutazione termosensibile c h Fenotipi simili in specie diverse dovuti al genotipo ch/ch: forte riduzione di melanina nelle parti più calde del corpo

Mutazioni biochimiche Alterano la capacità di un organismo di sintetizzare un particolare composto essenziale per la crescita. Sono facilmente isolabili nei microrganismi come E. coli, neurospora e lievito Microrganismi di tipo selvatico sono chiamati prototrofi in quanto in grado di crescere su terreno minimo (costituito da uno zucchero come fonte di carbonio, alcuni sali ed elementi in tracce) I mutanti biochimici nutrizionali sono definiti auxotrofi. Per poter crescere necessitano della somministrazione di specifici nutrienti che sono incapaci di sintetizzare es: bio- met - arg -

Mutazioni per resistenza nei microorganismi Mutazioni che determinano la capacita di resistere a sostanze tossiche o a organismi patogeni cui invece il genotipo standard e sensibile. Esempio classico resistenza dei batteri agli antibiotici, oppure all’azione di alcuni virus, o batteriofagi

Distinzione funzionale delle mutazioni mutazione nulla (con perdita di funzione) m Mutazioni con perdita o riduzione di funzione La mutazione è recessiva se il prodotto è assente o ridotto, inattivo o parzialmente attivo. La riduzione del 50% (o meno) della funzione nell’eterozigote basta a garantire una funzione normale e un fenotipo selvatico; in questo caso l’allele selvatico è aplo-sufficiente La mutazione è dominante se la riduzione del 50% nell’eterozigote non basta a garantire la funzione normale; in questo caso l’allele selvatico è aplo-insufficiente Amorfe mutazione con parziale perdita di funzione m 1 Ipomorfe Mutazioni con acquisto di funzione Neomorfe, antimorfe mutazione con acquisto di funzione M In genere dominanti • Proteina con struttura e funzione alterate; oltre a non svolgere la normale funzione interferisce con il l’attività della forma normale (prodotta dall’allele selvatico) effetto dominante negativo Acquisto di funzione

Le mutazioni in geni aplo-sufficienti sono recessive

Le mutazioni dominanti: aplo-insufficienza e dominanza negativa

I sistemi di rivelazione delle mutazioni E’ necessario possedere dei metodi per rivelare gli effetti degli alleli mutanti I metodi di rivelazione delle mutazioni agiscono a vari livelli fenotipici Il fenotipo degli alleli mutanti recessivi non deve essere mascherato dall’allele selvatico

Mutazioni nella specie umana In genetica umana le mutazioni vengono identificate in base alla comparsa di un fenotipo anomalo in un pedigree Fenotipi recessivi Fenotipi dominanti

Negli organismi aploidi tutte le mutazioni si manifestano es. Neurospora La Neurospora crassa è una muffa del pane appartenente agli ascomiceti Esempio: mutanti ad-3 accumulano un pigmento rosso quando crescono a bassa concentrazione di adenina

Le mutazioni sono rare pertanto occorrono dei metodi per identificarle e isolarle üusare sistemi selettivi (tecniche realizzate per facilitare l’isolamento di tipi mutanti desiderati dal resto degli individui) üaumentare il tasso di mutazione con l’uso di mutageni

Tecnica del replica plating nei batteri Batteri piastrati su terreno solido completo formano colonie. Si fa una replica su terreno minimo e si paragonano le colonie con quelle della piastra madre Le colonie assenti sulla replica ma presenti sulla piastra madre saranno mutanti nutrizionali (auxotrofi)

Arricchimento di batteri auxotrofi mediante penicillina +penicillina (per isolare mutanti leu-) auxotrofo terreno minimo prototrofo I batteri sono sensibili alla penicillina durante lo stadio di proliferazione Es: in terreno minimo con aggiunta di leucina crescono i mutanti auxotrofi leu-

La resistenza di E. coli al fago T 1 Infezione di E. coli col fago T 1 provoca la lisi della maggior parte delle cellule. Solo le cellule che hanno acquisito resistenza nei confronti del fago non vengono lisate. La resistenza si acquisisce spontaneamente o è indotta dall’esposizione al fago?

I batteri resistenti sono preesistenti all’esposizione al fago? (Lederberg 1952) Joshua Lederberg (1952) Nelle varie piastre replicate, le colonie di E. coli resistenti al fago T 1 si trovano nelle stesse posizioni che sono anche le stesse della piastra madre

Se le mutazioni di resistenza si fossero verificate dopo l’esposizione al fago la distribuzione delle colonie resistenti nelle piastre replicate sarebbe stata causale e quindi diversa tra le diverse piastre

La frequenza delle mutazioni geniche Frequenza di mutazione = frequenza con cui una mutazione compare in una popolazione di individui o cellule (gameti o altro tipo cellulare) Esempi negli eucarioti

Effetto mutagenico dei raggi X in Drosophila Hermann J. Muller H. J. Muller fu il primo genetista ad elaborare un metodo per analizzare gli effetti dei raggi X sulla frequenza di mutazioni spontanee in Drosophila melanogaster. Muller, mediante incroci e ricombinazioni, costruì un particolare tipo di cromosoma X (cromosoma Cl. B) che consentiva di isolare mutazioni letali recessive

Il cromosoma C L B C= inversione; L =mutazione letale recessiva; B= mutazione Bar dominante L Inversione C Bar Una cromosoma X CLB possiede un’inversione (C) che impedisce la ricombinazione, un allele letale recessivo (L) e la mutazione dominante Bar (occhio di dimensioni ridotte).

Il cromosoma C l B Se una femmina eterozigote per il cromosoma Cl. B e un cromosoma normale è incrociata con un maschio con X normale il rapporto sessi osservato nella progenie di questo incrocio è 2 (femmine) : 1 (maschi)

Il test CLB Muller irradiò con raggi X maschi di Drosophila di una popolazione selvatica e li incrociò con femmine Cl. B/+. Indichiamo il cromosoma X irradiato con un asterisco

Muller incrociò singole femmine Cl. B/* della F 1 con maschi normali Presenza/assenza di maschi F 2 che hanno ricevuto il cromosoma X irradiato dalle loro madri Se sul cromosoma X è stata indotta una mutazione letale recessiva nella F 2 non nasceranno maschi

Il test CLB (solo simboli) RX femmine CLB/+ x maschi +/Y F 1 femmine Bar CLB/+ x +/Y singole femmmine CLB/Y muoiono CLB/m x +/Y singole femmmine +/Y nascono CLB/Y muoiono

Muller trovò una frequenza spontanea di mutazioni letali pari a 1, 5 per 1000 cromosomi. In seguito a irradiazione con i raggi X (1000 roentgen) la frequenza di mutazioni letali arrivava 1, 7%, circa 10 volte superiore

Relazione lineare tra dose di RX somministata e % di mutazioni letali recessive X-linked in Drosophila Non c’è effetto soglia, ovvero non esiste una dose di radiazioni che non produce effetti mutagenici

Le radiazionizzanti causano rotture della doppia elica e inducono aberrazioni cromosomiche

L’effetto mutagenico delle radiazionizzanti sul materiale genetico era quindi noto già alla fine degli anni ‘ 20 grazie agli esperimenti di Muller e di altri ricercatori che ottennero risultati simili nel mais e nelle vespe. Per i risultati dei suoi studi, nel 1946 Muller ottenne il Premio Nobel per la Medicina e Fisiologia Muller cercò di mettere in guardia la classe politica sui rischi a breve e lungo termine delle radiazioni

Hiroshima: 6 agosto 1945 Nagasaki: 9 agosto 1945

Uccise sul colpo circa 200. 000 persone Circa il 90% degli edifici distrutti Decine di migliaia di feriti Effetti a lungo termine