LE MUTAZIONI 1 Mutazione Qualsiasi cambiamento PERMANENTE del

LE MUTAZIONI 1

Mutazione Qualsiasi cambiamento PERMANENTE del patrimonio genetico E’ un evento CASUALE, RARO tasso di mutazione nell’uomo: 1 gamete su un milione è portatore di una mutazione a un determinato locus 2

Tasso di mutazione ¯ 1 gamete su 106 porta una mutazione a un determinato locus ¯ Nel genoma umano ci sono c. a. 20. 000 geni ¯ In totale i gameti portatori di mutazione a un qualsiasi locus codificante saranno 20. 000 x 10 -6 = 2% 3

Tasso di mutazione e frequenza di mutazione Il tasso di mutazione misura la frequenza con cui una mutazione si origina ex novo in un’unità di tempo “biologico” (di solito una generazione) La frequenza di mutazione misura la frequenza della mutazione in una popolazione nel momento dell’osservazione Il tasso di mutazione è di una nuova mutazione ogni 7 divisioni cellulari La frequenza di mutazione nella 4° generazione è di 2 mutanti su 8 cellule

Mutazioni e selezione Dal punto di vista selettivo una mutazione può risultare: Vantaggiosa l’organismo che la porta ha una “fitness” (capacità riproduttiva) maggiore Svantaggiosa l’organismo che la porta ha una fitness minore Neutra non influenza la fitness di chi la porta 5

Esistono centinaia di diverse emoglobine mutanti in tutta la popolazione umana. Molte di queste forme mutanti sono dannose e danno origine a forme patologiche. Altre sono "neutre" e non sembra arrechino ai portatori nè vantaggi ne svantaggi. 6

Mutazioni e selezione L’effetto delle mutazioni va sempre correlato all’ambiente in cui l’organismo si trova: una data mutazione può rivelarsi svantaggiosa (o neutra) in un dato ambiente, vantaggiosa in un altro. 7

Melanismo industriale e selezione naturale Prima della rivoluzione industriale uno strato di licheni di colore grigio chiaro ricopriva i tronchi degli alberi in gran parte dell’Inghilterra. Molte specie di insetti tra cui le falene (Biston betularia), vivevano sui licheni ben mimetizzate alla vista dei predatori. In seguito alla industrializzazione molti dei licheni scomparvero per inquinamento ambientale, ed alberi e rocce annerirono a causa dei fumi inquinanti. 8

Melanismo industriale e selezione naturale Le falene maculate che a maggioranza popolavano le campagne inglesi vennero così a trovarsi completamente esposte allo sfondo scuro dei tronchi. Nel 1948 la percentuale di individui scuri di falena cominciò ad aumentare nei sobborghi cittadini fino ad arrivare al 98% nei sobborghi di Manchester, ed il fenomeno fu definito “melanismo industriale”. L’apparire delle falene melanizzate era dovuto ad una mutazione spontanea in un gene, seguito dalla selezione naturale in un ambiente in cui il mancato mimetismo sfavoriva la sopravvivenza delle falene maculate a causa di uccelli predatori. 9

Mutazioni e selezione Mutazione anemia falciforme (sostituzione Glu-Val in catena b dell’emoglobina) vantaggiosa o svantaggiosa? 10

Fenotipo degli omozigoti per la mutazione b. S (anemia falciforme) un gene mutato, molti sintomi Un unica sostituzione aminoacidica nell’emoglobina Dolore, ulcere alle gambe, danni a ossa, polmoni, reni, occhi, calcoli biliari, ittero, anemia, ritardo di crescita Gli omozigoti SS non si riproducono a causa della grave malattia genetica; in omozigosi è sicuramente svantaggiosa in qualsiasi 11 ambiente.

Selezione a favore dell’eterozigote In zone malariche i portatori (eterozigoti per la mutazione b. S) sono avvantaggiati rispetto agli omozigoti selvatici. In ambiente non malarico i portatori e gli omozigoti per l’allele selvatico hanno la stessa fitness. Portatori sani Affetto Selvatico La resistenza alla malaria degli eterozigoti è dovuta al fatto che il Plasmodio non riesce a completare il suo ciclo nei loro globuli rossi, a vita breve 12

Il vantaggio dell’eterozigote nelle regioni malariche Alcune varianti alleliche del gene b (la variante b. S in Africa, le varianti b. Thal nel Mediterraneo) di per sé dannose, hanno frequenze elevate in regioni malariche (o ex malariche). L’alta frequenza (fino al 30%) dell’allele S o dell’allele b. Thal nelle regioni malariche, è dovuta al fatto che l’eterozigote, a differenza dell’omozigote sano (che possiede due alleli b normali), non si ammala di malaria quindi ha > probabilità di riprodursi trasmettendo i suoi geni (quindi anche l’allele S o b. Thal) alla progenie rispetto al wild type 13

Mutazioni germinali e somatiche Per quanto riguarda la sede della mutazione è necessario distinguere: a) mutazioni germinali che colpiscono i gameti e possono essere trasmesse alla prole 14

Mutazioni germinali possono presentarsi in tutte le cellule germinali o solo in una proporzione di esse (mosaicismo germinale) a seconda dello stadio di sviluppo dell’embrione in cui sono avvenute, e una volta trasmesse alla prole diventano “stabili” Tutte le cellule (tutte le germinali + tutte le somatiche) portano la mutazione 15

Mosaicismo Coesistenza di 2 o + linee cellulari geneticamente distinte nello stesso individuo Mutazione che interviene in una cellula dello zigote o dell’embrione Tutte le cellule che originano da questa cellula porteranno la mutazione L’individuo risulterà essere un mosaico di cellule normali e di cellule mutate 16

Mutazioni germinali e somatiche Per quanto riguarda la sede della mutazione è necessario distinguere: a) mutazioni germinali che colpiscono i gameti e possono essere trasmesse alla prole b) mutazioni somatiche colpiscono le cellule somatiche e si esauriscono nell’individuo. La mutazione viene trasmessa attraverso la mitosi alla progenie della cellula colpita in origine = l’individuo sarà un mosaico 17

Mosaicismo somatico La pigmentazione asimmetrica della pelle osservata nella sindrome di Cune Albright è associata a mutazioni nel gene GNAS 1 in alcune ma non in tutte le cellule 18

Mutazione Può essere minima, riguardare cioè una singola coppia di basi nel DNA MUTAZIONE PUNTIFORME oppure implicare regioni piu’ estese dentro un gene MUTAZIONE GENICA fino anche a grosse porzioni del genoma MUTAZIONE CROMOSOMICA 19

Mutazioni cromosomiche - anomalie di numero (POLIPLOIDIE, ANEUPLOIDIE) conseguenza di anomalie nella fecondazione o di errori di segregazione dei cromosomi durante la formazione dei gameti 20

Poliploidia presenza di un numero di cromosomi corrispondente a un multiplo del corredo aploide (n) 21

Poliploidia presenza di un numero di cromosomi corrispondente a un multiplo del corredo aploide (n). Es: triploidia 3 n Origine della triploidia: difetto di fertilizzazione uovo aploide fecondato da due spermatozoi aploidi fecondazione tra gamete diploide e gamete aploide 22

Nelle piante è possibile indurre la poliploidia usando determinate sostanze chimiche colchicina Non disgiunzione meiotica Gameti diploidi 23

La poliploidia è comune nelle felci, nelle piante da fiore, nel frumento, sia in natura che nelle varietà selezionate dall’uomo 24

La poliploidia è rara negli animali, nei mammiferi è sempre incompatibile con la vita 25

Aneuploidia: presenza di cromosomi in più o in meno rispetto al corredo diploide (2 n+1, 2 n-1…) 26

Effetto aneuploidie 2 n - 1 2 n 2 n + 1 Diminuisce o aumenta la quantità di m. RNA e quindi di proteine sintetizzate (vale per tutti i geni localizzati sul cromosoma interessato) Sbilanciamento del dosaggio genico 27

Mutazioni cromosomiche - anomalie di numero (ANEUPLOIDIE, POLIPLOIDIE) conseguenza di errori di segregazione dei cromosomi durante la formazione dei gameti, o di anomalie nella fecondazione - anomalie di struttura conseguenza di rotture cromosomiche 28

Anomalie di struttura dei cromosomi * 29

Conseguenze delle anomalie strutturali Duplicazioni/delezioni: sbilanciamento del dosaggio genico (monosomia / trisomia parziale) ¯ Inversioni/traslocazioni: potrebbe esserci rottura genica (la rottura avviene proprio all’interno di un gene) ¯ 30

Esempio di traslocazione reciproca 9 -22 in CML (leucemia mieloide cronica) Avviene nelle cellule staminali ematopoietiche La rottura avviene a livello di due geni, con formazione di un gene di fusione La proteina di fusione bcr-abl porta a crescita cellulare incontrollata 31

Mutazione Può essere minima, riguardare cioè una singola coppia di basi nel DNA MUTAZIONE PUNTIFORME 33

Mutazioni conseguenze (1) Un’alta % (98%) del nostro genoma contiene regioni non codificanti. Le mutazioni che riguardano queste regioni non hanno di solito alcuna particolare conseguenza sul fenotipo, sono quindi selettivamente neutre 34

Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non codificanti Gene 1 Gene 2 Gene 3 mutazione 35

Queste mutazioni sono selettivamente neutre, determinano la variabilità genetica individuale polimorfismi del DNA (SNP, VNTR, SSRs) Identificazione individuale (medicina forense, paternità) I polimorfismi si trovano in zone del DNA che non hanno alcuna funzione codificante: rappresentano delle varianti fenotipicamente invisibili che hanno l’utilità di marcare molecolarmente la variabilità fra individuo e individuo. 36

Polimorfismi del DNA esempio: Microsatelliti (o Short Tandem Repeats) sequenze ripetute di DNA non codificante costituiti da unità di ripetizione molto corte (1 -5 bp). Per un determinato microsatellite possono esistere numerosi alleli diversi, che differiscono tra loro per il numero di ripetizioni Trinucleotide repeat CTT Gli alleli differiscono per il numero delle ripetizioni CTT 37

Poiché il numero di varianti alleliche (numero di ripetizioni) al singolo locus (microsatellite) presenti nella popolazione è elevato, è probabile che individui diversi abbiano genotipi diversi 7, 8 6, 10 8, 8 8, 9 7, 9 6, 8 38

Applicazioni in medicina legale L’analisi contemporanea di tanti polimorfismi permette di identificare un singolo individuo in modo pressochè univoco polimorfismo A polimorfismo B Genotipo individuo sospetto 1 al locus A: A 2/A 4 , al locus B: B 3/B 7 Genotipo individuo sospetto 2 al locus A: A 2/A 5, al locus B: B 4/B 4 Genotipo tracce biologiche sul luogo delitto: A 2/A 5 B 4/B 4 39

Mutazioni intrageniche promotore Gene mutazione Una mutazione che cade in sequenze regolatrici potrebbe alterare il legame coi fattori di trascrizione, influendo sul livello di trascrizione del gene (quantità di m. RNA) 40

Mutazioni intrageniche Esone introne Esone splicing mutazione Mutazioni che avvengono nelle sequenze introniche di solito non hanno effetto sul fenotipo, a meno che non cadano in particolari sequenze localizzate ai confini tra esone e introne mutazioni di splicing 41

Intron retention Exon skipping 42

Mutazioni intrageniche Esone introne Esone splicing mutazione 43

Mutazioni conseguenze (2) Le mutazioni che riguardano porzioni codificanti di geni (ESONI) di solito hanno delle conseguenze fenotipiche perché possono comportare cambiamenti nella sequenza aminoacidica codificata. Es: SOSTITUZIONI DI SINGOLE BASI MUTAZIONE MISSENSO GAA GAT (glu-asp) MUTAZIONE NONSENSO GAG TAG (glu-stop) N. B. spesso però una mutazione riguardante la terza base di un codone non ne cambia il significato (ridondanza codice genetico): MUTAZIONE SINONIMA (NEUTRA): GAA GAG (glu-glu) 44

nonsenso GAG TAG (glu-stop) sinonima GAA GAG missenso GAA GAT (glu-asp) 45

Mutazioni in sequenza codificante e conseguenze sulla traduzione: mutazione missenso 46

Effetto di una mutazione missenso La mutazione potrà inserire un aminoacido con le stesse caratteristiche chimiche (ingombro sterico, carica elettrica) di quello originario. In questo caso gli effetti sulla proteina saranno minimi. La sostituzione con un aminoacido con caratteristiche chimiche diverse produrrà invece un cambiamento nella struttura della proteina e di conseguenza della sua funzione 47

Esempio di mutazione missenso Anemia falciforme: mutazione missenso nel gene bglobina. L’acido glutammico in posizione 6 (carico negativamente) viene sostituito da valina (idrofobico) 48

Esempio di mutazione missenso La valina in posizione 6 interagisce con una valina di un’ altra molecola di emoglobina, formando aggregati molecolari che precipitano nel globulo rosso 49

Mutazioni in sequenza codificante e conseguenze sulla traduzione: mutazione nonsenso Una mutazione nonsenso porterà alla sintesi di una proteina tronca 50

Mutazioni conseguenze (3) Mutazioni in sequenze INSERZIONE/DELEZIONE codificanti che comportano di basi (in n° ≠ 3) causano slittamento della cornice di lettura e hanno sempre conseguenze fenotipiche (di solito svantaggiose): proteina diversa e terminazione prematura. Sono dette MUTAZIONI FRAMESHIFT 51

Mutazioni “frameshift” Viene alterata la lettura di tutti i codoni a valle dell’inserzione /delezione Delezione di 3 nt non provoca frameshift 52

Antigeni di superficie: il gruppo sanguigno AB 0 Gli alleli A e B codificano per due glicosiltransferasi con diversa specificità L’allele 0 codifica per una forma inattiva di glicosiltransferasi 53

Esempio mutazione frameshift Delezione di singolo nucleotide nell’ allele 0 del locus AB 0 provoca cambiamento del modulo di lettura dal codone 86 e terminazione prematura 30 aa dopo. La glicosiltransferasi codificata dall’allele 0 è inattiva. 54

Esempio di delezione di 3 nucleotidi Fibrosi Cistica: delezione di un codone nel gene CFTR che porta alla sintesi di un polipeptide mancante di un aminoacido 55

MUTAZIONI CAUSE SPONTANEA insorge in assenza di agenti mutageni esterni ed è prodotta da errori nei processi di ricombinazione, replicazione e/o riparazione del DNA INDOTTA da agenti mutageni chimici o fisici 56

Mutazione da errore di ricombinazione: crossing over ineguale 57

Mutazione da errore di replicazione Il processo di replicazione del DNA rappresenta la principale fonte di mutazioni. Tutti gli organismi possiedono due meccanismi fondamentali di salvaguardia della fedeltà dell’informazione molecolare: ¯Correzione di bozze (corregge gli errori di appaiamento commessi dalla DNA polimerasi mentre la replicazione è in corso) C G T GAACTG GCAT C G T GAACTG GCACTT. . . T ¯Riparazione degli appaiamenti errati dopo replicazione del DNA 58

Mutazioni indotte da agenti mutageni Il tasso naturale di mutazione del DNA viene incrementato dall’interazione ambientale con agenti chimici e fisici MUTAGENI 59

Mutageni chimici ¯ Esistono varie sostanze chimiche interagiscono con il DNA modificando e/o danneggiando le basi azotate e causano appaiamenti errati 60

Mutageni chimici I mutageni chimici possono causare sostituzioni di nucleotidi esempio: aflatossina B 1 micotossina presente in alcune muffe. In condizioni ambientali favorevoli le spore degli Aspergillus germinano e successivamente colonizzano svariate tipologie di alimenti, quali mais, arachidi ed altri semi oleosi. 61

Mutageni chimici I mutageni chimici possono causare inserzioni o delezioni di nucleotide Esempio: benzopirene nel fumo di sigaretta, nello scarico dei motori Diesel, nella carbonizzazione dei cibi… 62

Fumo, cancro e riparazione del DNA La capacità di riparare i danni al DNA arrecati dal fumo (ossidazione delle guanine) dipende dall’ enzima OGG (8 -oxoguanine DNA N-glycosylase). Esiste una variabilità individuale nella produzione dell’enzima. La variante allelica 326 Ser del gene h. OGG 1 ha un’attività enzimatica maggiore della variante 326 Cys. I fumatori non hanno tutti lo stesso rischio di cancro: chi ha bassa attività di OGG ha un rischio decisamente maggiore (30 -120 volte) di chi, a parità di n° sigarette fumate, ha naturalmente alti livelli di OGG Il danno finale è il risultato di due fattori di rischio indipendenti: Il fumo + la ridotta capacità di riparare le guanine modificate 63

Mutageni fisici ¯ Radiazioni UV a bassa energia, poco penetranti ¯ Radiazionizzanti (raggi X, raggi a, b, g), ad alta energia, altamente penetranti 64

Meccanismo di mutagenicità UV ¯ Il danno è localizzato a livello superficiale (pelle) ¯ Inducono la formazione di dimeri di timina (formazione di legame covalente tra due T adiacenti sullo stesso filamento) ¯ Per ogni secondo di esposizione al sole si producono 50 -100 dimeri in ogni cellula della pelle di cui il 2% cadono in coding sequences 65

Meccanismo di mutagenicità radiazionizzanti ¯ A causa della loro alta energia hanno un forte potere penetrante ¯ Trasferiscono energia alle molecole biologiche con cui collidono (DNA, lipidi, proteine) modificandole e danneggiandole 66

Danni al DNA da radiazionizzanti a b c a) Rottura di singolo filamento b) Rottura del doppio filamento c) Modificazione chimica delle basi d) Rimozione di singole basi d 67