FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI

FORMAZIONE DEL PATTERN ASSIALE

GENERAZIONE DI MUTANTI MUTAGENESI CHIMICA MUTAGENESI PER INSERZIONE

MUTAGENESI CHIMICA può essere condotta direttamente sui semi. chimici MUTAGENI esteri dell’acido etilmetansulfonico (EMS) caffeina, nicotina radiazioni EMS alchila le G Agenti alchilanti UV, raggi X radiazioni a, b, g la G alchilata si appaia con T invece che con C

MUTAGENESI PER INSERZIONE: TRASPOSONI , T-DNA

MUTAGENESI CHIMICA DEI SEMI Vengono utilizzati semi maturi, con gli embrioni completamente sviluppati. Si trattano i semi con il mutageno Mutazioni a carico di una cellula producono una linea clonale di cellule mutate, durante il successivo sviluppo post -embrionale con il conseguente sviluppo di piante eterozigoti con settori mutanti. (M 1) Solo se i settori mutati includono lo strato L 2 del meristema apicale, da cui sarà generata la linea germinale della pianta matura, la mutazione passerà alla successiva progenie. I fiori mutanti produrranno (autofecondazione) il 25% di semi omozigoti riconoscibili per il loro fenotipo aberrante.

confronto tra mutagenesi chimica e mutagenesi per inserzione

MEDIANTE LA MUTAGENESI PER INSERZIONE IL GENE VIENE “ETICHETTATO” (GENE TAGGING), PERMETTEDONE UNA IDENTIFICAZIONE PIU AGEVOLE

Strategia di isolamento di mutanti Trasformazione con T-DNA Raccolta semi T 1 T 0 Autoimpollinazione T 2 Ks Selezione in serra dei trasformanti T 1 Kr Analisi in vitro delle plantule Kan resistenti Raccolta semi T 2 • Analisi dei mutanti Kan resistenti • Propagazione delle piante

Identificazione delle sequenze fiancheggianti il DNA inserito gene x T-DNA gene x

PCR inversa T-DNA o DS primers

RB Recupero del plasmide T-DNA Ori Kan. R LB GENE Eco. RI T-DNA RB p. BR 322 Kan. R LB Eco. RI Digestione con Eco. RI T-DNA RB Eco. RI p. BR 322 Kan. R LB Eco. RI

Recupero del plasmide Ligazione Trasformazione E. coli Su terreno selettivo contenente Kanamicina cresceranno solo le colonie che hanno acquisito il plasmide Da queste sarà possibile recuperare il plasmide e sequenziarlo

Mutanti MONOPTEROS (MP) • La mutazione produce piantine che mancano di ipocotile e radice ma che hanno la regione apicale • Tuttavia la struttura delle regioni apicali non è normale e i tessuti dei cotiledoni sono disorganizzati • Embrioni d. I mutanti mp non formano il procambio nella parte basale dell’embrione globulare, la regione che dà luogo all’ipocotile e alla radice I DIFETTI COMPAIONO NELLO STADIO DI OTTANTE

STADI DI SVILUPPO DI MONOPTEROS I mutanti bodenlos e AXR 6 hanno un fenotipo simile a monopteros

Funzione del gene MONOPTEROS (formazione della radice embrionale) il meristema radicale (cq, columella) in Arabidopsis origina da una singola cellula: l’ipofisi L’ipofisi si differenzia a partire da una cellula extraembrionale e ciò richiede l’espressione di due geni: MONOPTEROS (MP) e BODENLOS (BD) I trascritti di MP e BD si accumulano in cellule del proembrione adiacenti alla cellula extraembrionale che si differenzierà in ipofisi MP e BD sono dei fattori di trascrizione coinvolti nella risposta all’auxina MP appartiene alla classe dei fattori di trascrizione ARF (ARF 5) regolatori positivi della risposta a IAA BD appartiene alla classe delle proteine IAA (IAA 12) regolatori negativi della risposta all’auxina

Destino differenziativo delle due cellule del’embrione bicellulare cellula basale cellula apicale Il meristema apicale della radice ha un’origine mista

Regolazione dell’espressione genica da parte dell’auxina Geni di risposta primaria (geni precoci): l’espressione è indotta dalla attivazione di fattori di trascrizione già presenti (non è necessaria sintesi proteica) (oppure dalla inattivazione di inibitori della trascrizione preesistenti) Tali geni codificano per FATTORI DI TRASCRIZIONE i quali determinano l’espressione dei Geni di risposta secondaria (geni tardivi) (Per l’espressione di tali geni e quindi per la risposta è necessaria nuova sintesi proteica)

5 classi principali di geni precoci la cui trascrizione è indotta da IAA 1. Proteine AUX/IAA 2. Proteine SAUR 3. Proteine GH 3 4. Glutatione S-trasferasi 5. ACC sintasi

Le proteine AUX/IAA auxin response factors: ARF auxin responsive elements: TGTCTC

Regolazione dell’ espressione genica da parte dell’auxina

IAA signaling: regolato dalla via del proteosoma /ubiquitina

Via del proteosoma/ ubiquitina E 1 enzima attivante l’ubiquitina E 2 enzima coniugante l’ubiquitina E 3 enzima legante l’ubiquitina

IAA: induce la trascrizione dei geni precoci promuovendo la degradazione di repressori AUX/IAA mediata dal PROTEOSOMA consentendo la formazione di dimeri ARF attivi Feedback negativo: tra i geni precoci indotti da IAA ci sono le proteine AUX/IAA

Mutante TIR-1 TIR 1: proteina F-box (F-box N-terminale/LRR C terminale) E 3: 4 subunità = Cullin 1/Cdc 53 Skp/ASK 1 Rbx 1/ROC 1/Hrt 1 F-box

In Arabidopsis: 23 ARF 28 AUX IAA La maggior parte delle AUX IAA funzionano come repressori della trascrizione di geni indotti da IAA Identificate 8 mutazioni in AUX IAA che influenzano lo sviluppo embrionale Sono tutte relative a mutazioni di singoli aacidi nel dominio II di degradazione delle proteine AUX IAA (proteosoma) Acquisizione di resistenza alla degradazione tramite la via del Proteosoma

BODENLOS (IAA 12): il fenotipo dei mutanti assomiglia ai mutanti mp Codifica per una forma mutata di proteina AUX/IAA (IAA 12) (repressore della risposta all’auxina) La forma mutata è resistente alla degradazione mediata dal proteosoma e indotta dall’auxina che è necessaria per la risposta differenziativa

I mutanti mp e bdl hanno difetti nel piano di divisione dell’ipofisi sebbene le proteine vengano espresse nelle cellule superiori adiacenti Meccanismo non-cell autonomous Cell to cell signaling

Modello per la formazione della radice embrionale: §L’auxina si accumula nella ipofisi prima del suo differenziamento §Questo accumulo richiede la localizzazione polare del carrier di efflusso PIN 1 nelle cellule adiacenti del proembrione §L’auxina è il segnale generato dall’interazione MP/BD §PIN 1 è espresso nelle stesse cellule in cui vengono espressi MP e BD

Gene reporter GUS (or GFP) TGTCTC Aux. RE The DR 5 reporter construct is widely used to monitor auxin response-level. Hours of staining DR 5 consists of seven repeats of an auxin-response element (Aux. RE) which is a binding site for auxin-responsive transcription factors (ARFs). Auxin-response level increases with exogenous auxin (NAA) Ulmasov, T. , Murfett, J. , Hagen, G. , and Guilfoyle, T. J. (1997). Aux/1 AA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9: 1963 -1971.

AUXINA (segnale primario nelle cellule adiacenti l’ipofisi) MP e BDL agiscono in maniera non-cell autonomous Rilascio di un segnale secondario nell’ipofisi AUXINA? (trattamenti con 2, 4 D di bdl inefficaci) fattori di trascrizione TOM (targets of monopteros) espressi nellle stesse cellule di MP e BDL: TOM 3 migra nell’ipofisi

MUTANTI AXR 6 mostrano lo stesso fenotipo di mp e bdl AXR 6 codifica per CULLIN 1 del complesso E 3

Mutanti GNOM • Piantine omozigoti gnom mancano di radici e cotiledoni • I difetti nell’embrione appaiono alla prima divisione dello zigote e rimangono per tutta l’embriogenesi • I mutanti più estremi sono sferici • abolita completamente la polarità assiale GNOM necessario per la determinazione della polarità assiale

SVILUPPO DEL MUTANTE gnom WT gnom

Il fenotipo dei mutanti gnom è simile a quello dei doppi mutanti mpbdl Ridotta capacità di risposta all’auxina? In embrioni di Brassica juncea il fenotipo gnom può essere fenocopiato con inibitori del trasporto di auxina

Funzione del gene GNOM codifica per un fattore di scambio GTP/GDP che si associa a piccole proteine G della classe ARF (ARF-GEF) Le proteine ARF (ADP ribosylation factor) sono coinvolte nella regolazione del trafficking intracellulare delle vescicole In Arabidopsis GNOM (EMB 30) controlla la localizzazione del carrier per l’auxina PIN 1 durante l’embriogenesi Mutazioni gnom aboliscono il trasporto polare dell’auxina nell’embrione

ADP ribosilazione Complessi GEF-ARF

Formazione di vescicole nel TGN

ARF serve a reclutare proteine di rivestimento sulle vescicole

Modello per il trafficking di proteine In Arabidospis

I geni GNOM determinano la distribuzione dei carrier di efflusso di IAA (proteine PIN) PIN 1 TIBA e NPA (inibitori del trasporto di IAA) possono interferire con il riciclo di PIN

The PIN proteins are named for the pin-formed mutant pin-formed, which has a mutation in the PIN 1 gene, makes some abnormal leaves and then a bare inflorescence. Galweiler, L. , Guan, C. , Muller, A. , Wisman, E. , Mendgen, K. , Yephremov, A. , and Palme, K. (1998). Regulation of polar auxin transport by At. PIN 1 in Arabidopsis vascular tissue. Science 282: 2226 – 2230, reprinted with permission from AAAS.

PIN auxin efflux carriers are encoded by a large gene family with cell-specific expression patterns PIN Křeček , P. , Skůpa , P. , Libus, J. , Naramoto, S. , Tejos, R. , Friml J. , and Zažímalová, E. (2009) The PINFORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.

PIN proteins orient asymmetrically in plant cells PIN 1 localizes to the lower surface of root cortex cells Root Base PIN 1 is responsible for auxin flow from shoot apex to root apex. Root Apex Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P. , et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962 -966. Reproduced with permssion from Dolan, L. , et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: 71 -84.

PIN proteins orient differently PIN 2 localizes to the lower surface of root cortex cells and the upper surface of epidermal cells. PIN 2 is functions primarily in the redistribution of auxin during root gravitropism Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd. Dhonukshe, P. , et al. (2008). Generation of cell polarity in plants links endocytosis, auxin distribution and cell fate decisions. Nature 456: 962 -966. Reproduced with permssion from Dolan, L. , et al. (1993). Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development 119: 71 -84.

The distribution of PIN proteins contributes to the auxin gradients Křeček , P. , Skůpa , P. , Libus, J. , Naramoto, S. , Tejos, R. , Friml J. , and Zažímalová, E. (2009) The PINFORMED (PIN) protein family of auxin transporters. Genome Biology 10: 249.

PIN protein distributions contribute to auxinmediated patterns Amongst other things, they specify the location of auxin maxima necessary for embryonic patterning. Reproduced with permission from Petrášek, J. , and Friml, J. (2009) Auxin transport routes in plant development. Development 136: 2675 -2688.

PIN proteins can move very dynamically within cells and tissues Unlike the more stablyoriented ABCB proteins, PIN proteins can rapidly change their positions within cells. Reprinted from Heisler, M. G. , et al. (2005). Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem. Curr. Biol. 15: 1899– 1911, with permission from Elsevier.

PIN proteins cycle between plasma membrane and endosome PIN proteins continually cycle between the plasma membrane and endosomal compartments. endosome Plasma membrane Redrawn from Kleine-Vehn, J. , et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839 -3849.

Brefeldin A blocks endocytosis and traps PIN proteins Brefeldin A (BFA) prevents endosomes from fusing with the plasma membrane, trapping PIN in the endosomal compartments. Control BFA treatment Redrawn and reprinted from Kleine-Vehn, J. , et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinasemediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839 -3849.

The phosphorylation state of PINs affects their distribution P P PIN proteins are phosphorylated by the protein kinase PINOID (PID) and dephosphorylated by the protein phosphatase PP 2 A. P P PP 2 A PID Control Staurosporine treated Staurosporine inhibits protein kinases Sukumar, P. , Edwards, K. S. , Rahman, A. , De. Long, A. , and Muday, G. K. (2009). PINOID kinase regulates root gravitropism through modulation of PIN 2 -dependent basipetal auxin transport in Arabidopsis. Plant Physiol. 150: 722 -735. Redrawn from Kleine-Vehn, J. , et al. (2009). PIN auxin efflux carrier polarity is regulated by PINOID kinase-mediated recruitment into GNOM-independent trafficking in Arabidopsis. Plant Cell 21: 3839 -3849.

ABCB proteins may stabilize PIN proteins within membrane domains ABCB 19 Plasma Membrane protein Orange = overlap The ABCB proteins seem to stay in the plasma membrane, unlike the PIN proteins. An interaction between the two transporters may contribute to stabilizing PINs. Titapiwatanakun, B. , and Murphy, A. S. (2009) Post-transcriptional regulation of auxin transport proteins: cellular trafficking, protein phosphorylation, protein maturation, ubiquitination, and membrane composition. J. Exp. Bot. 2009 60: 1093 -1107, by permission of the Society for Expiremental Biology.

LOCALIZZAZIONE DI PIN 1 e PIN 7 Stadio precoce IAA Stadio globulare

Localizzazione di PIN 1 e PIN 7 nello stadio precoce globulare e correlazione con la concentrazione di auxina

Localizzazione dell’auxina nel mutante gnom

Mutanti GURKE (pasticcino 3) Plantule omozigoti gurke sono prive dei cotiledoni mentre rimangono l’ipocotile e la radice Le plantule assomigliano a dei piccoli cetrioli (gurke)

Funzione del gene GURKE Ø Il gene GURKE codifica per la acetil-Co. A carbossilasi 1 (citosolica) Ø I mutanti gurke possono essere complementati dall’aggiunta di malonato

Complementazione della mutazione acc 1 (gurke like) con malonato embrioni immaturi di arabidopsis espiantati dalla siliqua e coltivati in vitro 3 m. M malonato

Sviluppo di embrioni del mutante pasticcino 3 (gurke like) durante la germinazione complementazione da malonato 1 m. M malonato

Biosintesi degli acidi grassi malonato + Co. A malonil. Co. A sintetasi malonil. Co. A ACCasi: catalizza la formazione di malonil-Coa da Acetil-Coa e CO 2 2 forme: citosolica (omodimerica): allungamento acidi grassi >20 C plastidiale (eteromerica): sintesi acidi grassi

La ACC 1 (citosol) serve alla biosintesi degli acidi grassi a lunghissima catena (VLCFA =>20) I VLCFA vengono incorporati negli sfingolipidi Contenuto di acidi grassi di semi di arabidopsis WT e mutanti Le mutazioni acc 1 -1; acc 1 -2; gurke; pas 3 sono alleliche I mutanti hanno un accumulo ridotto di VLCFA nei semi

Nei mammiferi è stato visto che gli sfingolipidi interagiscono colesterolo per formare domini raftlike ed hanno un ruolo nella regolazione della divisione cellulare

LIPID RAFTS: microdomini di membrana ricchi di colesterolo Dal 1972 (modello del mosaico fluido) si riteneva che fosfolipidi e proteine fossero simmetricamente distribuiti nelle membrane cellulari Nel 1988 K Simons (EMBL) e G van Meer (Utrecth) ipotizzarono l’esistenza di microdomini arricchiti in colesterolo, glicolipidi e sfingolipidi Alcune proteine associate a processi di signaling sembrano localizzarsi preferenzialmente nei lipid rafts doubly-acylated tyrosine kinases of the Src family ACILAZIONE Alcune di queste proteine si associano ai LR solo quando sono nello stato attivato B cell receptors (BCRs), T cell receptors (TCRs)

Mutanti FACKEL: Le mutazioni nel gene FACKEL determinano la delezione della parte centrale del’asse apicale-basale Mutanti fackel hanno i cotiledoni uniti direttamente alla radice

Funzione del gene FACKEL (FK): Codifica per una sterolo C-14 reduttasi biosintesi degli steroli In arabidopsis i livelli di sitosterolo campestrolo, stigmasterolo e brassinolide sono ridotti nei mutanti fk

mutante fk 0 10 50 100 Le mutazioni fk possono essere fenocopiate dal fenpropimorph, un inibitore della C-14 reduttasi mg/ml fenpropimorph

Mutazioni fk non sono complementate dall’aggiunta di brassinolidi gli steroli ( CH, ER, ST, ) che si accumulano nei mutanti fk responsabili degli effetti? trattamenti con CH, ER, ST dovrebbero FENOCOPIARE i mutanti fk

Non hanno difetti embrionali pur avendo livelli ridotti di steroli Mutanti BR sono complementati da BRs Mutanti fackel no

STEROLI Ø Componenti della membrana cellulare influenzano permeabilità e fluidità della membrana e l’attività di proteine animali: colesterolo piante: sitosterolo, campestrolo ØPrecursori degli ormoni steroidei animali: androgeni, estrogeni, glucocorticoidi piante: brassinosteroidi

STEROLI ANIMALI Essenziali per lo sviluppo embrionale COLESTEROLO Negli animali evidenze che sia coinvolto in vie di trasduzione del segnale che controllano la formazione del pattern (Hedgehog (Hh) transduction pathway: proteine Hh secrete , modificate da colesterolo promuovono interazioni con altre proteine per la trascrizione dei geni delle cicline E e D)

NELLE PIANTE GLI STEROLI POSSONO AVERE UN RUOLO NELL’EMBRIOGENESI? Nelle piante PHABULOSA (PHB) è un fattore di trascrizione Leucin –Zipper Homeodomain possiede un domain di binding per steroli/lipidi. E’ implicato nel controllo della formazione del pattern radiale nel germoglio