Metanogenesi E la reazione di formazione del metano

Metanogenesi E’ la reazione di formazione del metano ad opera di microorganismi (phylum Euryarchaeota – per lo più mesofili). E’ una forma di respirazione anaerobica in cui accettore di elettroni è il carbonio di composti a basso peso molecolare, quali CO 2, HCOOH, CH 3 OH. Quasi esclusivamente C 1 o cmq acidi carbossilici con gruppo metile (CH 3 COOH, CH 3 COCOOH) La reazione avviene solo in assenza di O 2 (è tossico per i metanogeni), in ambienti dove si ha decadimento della materia organica: • sedimenti anossici: paludi, acquitrini, sedimenti lacustri, risaie, … • zone umide di discarica • tratto digestivo di animali: rumine, intestino cieco (cavalli, conigli, …) o crasso (uomini, cani, …), intestino superiore di insetti cellulolitici (p. es. termiti) • sorgenti geotermali di H 2 e CO 2. • impianti di biodegradazione: digestori a fanghi attivi

Produzione di metano nel rumine

Gli Archaea e i metanogeni Ci sono 3 tipi di Archaea Crenarchaeota (Estremofili (termofili e psicrofili), acidofili) Euryarchaeota (metanogeni e alofili) Korarchaeota (nessun organismo isolato) Metanogeni: sono anaerobiotici obbligati Methanococcus jannischii was originally isolated from a sample taken from an oceanic depth of 2, 600 meters on the East Pacific Rise. It can be grown in a mineral medium containing only H 2 and CO 2 as sources of energy and carbon for growth within a temperature range of 50 to 86 degrees. Cells are irregular cocci that are motile due to two bundles of polar flagella inserted near the same cellular pole. Its genome has been sequenced completely.

GLI ARCHAEA METANOGENI ORDINE: METHANOBACTERIALES Famiglia: Methanobacteriaceae Genere: Methanobacterium Genere: Methanobrevibacter H 2/CO 2 Genere: Methanosphaera formiato Famiglia: Methanothermaceae Genere: Methanothermus ORDINE: METHANOCOCCALES Famiglia: Methanococcaceae Genere: Methanococcus LE REAZIONI 4 H 2 + HCO 3 - + H+ CH 4 + 3 H 2 O CH 3 OH + H 2 CH 4 + H 2 O H 2/CO 2 ORDINE: METHANOMICROBIALES Famiglia: Methanomicrobiaceae Genere: Methanomicrobium Genere: Methanogenium H 2/CO 2 Genere: Methanoculleus Genere: Methanospirillum Famiglia: Methanocorpusculaceae Genere: Methanocorpusculum H 2/CO 2 Famiglia: Methanoplanaceae Genere: Methanoplanus H 2/CO 2 Famiglia: Methanosarcinaceae Genere: Methanosarcina acetato H 2/CO 2 Genere: Methanococcoides Genere: Methanolobus methanolo Genere: Methanohalophilus Genere: Methanosaeta/Methanotrix acetato CH 3 COO- + H 2 O Acetotrofia CH 4 + HCO 3 -

CO 2 reduction Acetate fermentation

Metanogenesi Rappresenta il passaggio finale della decomposizione della materia organica. Durante tale decadimento accettori di elettroni come O 2, SO 4 2 -, NO 3 -, Mn(VI), Fe(III) vengono eliminati mentre si accumulano H 2 e CO 2. In queste condizioni avvengono Fermentazione Metanogenesi Fermentazione = è la degradazione anaerobica di composti organici come nutrienti (es glucosio) per ottenere composti organici più piccoli (es. lattato, acido acetico, etanolo) senza ossidazione. Metanogenesi = rimuove i prodotti finali di questo decadimento e permette di convertire rifiuti organici in “biogas”

Acetate fermentation CO 2 reduction

CH 4 prodotto/anno da batteri metanogenici = 109 tonnellate. Metà è utilizzato dai batteri metanotrofici, metà va nell’atmosfera (effetto serra). La biotrasformazione impiega cofattori che trasportano un atomo di C Metanofurano Tetraidro-metanopterina Coenzima M Co. M-SH è unico per i metanogeni, gli altri sono presenti anche in altri Archaea

formil-MFR formil-H 4 MPT metenil-H 4 MPT metilene-H 4 MPT metil-S-Co. M

Ruolo fisiologico delle idrogenasi L’attività dei batteri metanogenici è collegata al metabolismo di H 2. La reazione di ossidazione di H 2 produce e- e H+ sul lato esterno delle membrane. Gli elettroni attraversano la membrana e vengono utilizzati per la riduzione di HCO 3 a CH 4. A questa reazione è associata la sintesi di ATP. E’ presente una ADP/ATP translocasi che trasferisce ADP all’interno della membrana esterno membrana interno HCO 3 - + 9 H+ 4 H 2 8 e- 8 H+ ATPasi 2 H+ CH 4 + 3 H 2 O ADP + Pi ATP

Formil-metanofurano deidrogenasi L’enzima (FDH) catalizza la riduzione di CO 2 + MFR a N-formilmetano furano. Contiene Mo, un molibdopterina dinucleotide e cluster Fe-S Il coinvolgimento nella reazione del MFR rende lo step unico, tuttavia il meccanismo non lo è: sia Mo che Mo-pterina sono presenti anche in altri enzimi simili (xantina ossidasi che catalizza ox. di xantina ad acido urico). Methanobacterium wolfei contiene 2 FDH (I e II). FDHI predomina in cellule che crescono in presenza di Mo, FDH II in cellule che crescono in presenza di W. W-enzimi sono presenti anche in altri batteri anaerobici.

Donatori di elettroni nella metanogenesi F 420 H 2 assomiglia a FMN e a FAD. Trasferisce 2 e- come H- (come NADH)

Metil-H 4 MPT: Co. M metiltransferasi E’ un’enzima di membrana (Mtr) costituito da 8 subunità. Ognuna porta come gruppo prostetico la 5’-idrossibenzimidazolil-cobamide Quando il substrato e’ metanolo/metilammina /metilsolfuro si parte direttamente da qui, ossia dalla formazione di metil-Co. M

Metil-H 4 MPT: Co. M metiltransferasi Nella forma super-ridotta come cob(I)amide il cofattore accetta il gruppo metilico dal CH 3 -H 4 MPT producendo metil-cob(III)amide. CH 3 -H 4 MPT + E: Co. B(I) H 4 MPT + E: CH 3 -Co. B(III) In una seconda reazione il gruppo metilico viene trasferito a HS-Co. M rigenerando la forma ridotta (Co(I)) dell’enzima e metil-Co. M E: CH 3 -Co. B(III) + HS-Co. M CH 3 -S-Co. M + E: Co. B(I) Simili traferimenti di metili (ad es. formazione di metionina ad opera di metionina sintasi) avvengono in batteri ed eucarioti, ma utilizzano proteine solubili, con un sola subunità.

Zn(II) H O CH 3 Zn(II) +HS-Co. M -CH 3 S-Co. M -H 2 O Co(I) Co(III) Co(I) His 136

Metil-Co. M riduttasi Catalizza la formazione di CH 4 da metil-Co. M. Contiene come gruppo prostetico F 430, un nichel porfinoide con i 4 N pirrolici che coordinano il Ni. La riduzione dell’etero disolfuro e’ esoenergetica e associata alla sintesi di ATP Il Nickel (I) lega il CH 3, che viene ridotto e rilasciato come CH 4. A differenza di prima, quando col Co si aveva trasferimento e non riduzione. Co. B-SH, metil –S-Co. M e F 430 sono tipici di archaeobatteri metanogenici.

Quando non si parte da CO 2 …

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA E’ un processo metabolico molto meno esoergonico della respirazione aerobica o delle respirazioni anaerobiche La conversione di un esoso a CH 4 rilascia solo il 15% dell’energia ottenibile dalla degradazione aerobica C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 C 6 H 12 O 6 6 CO 2 + 6 H 2 O (DG°’ = -2870 k. J/mole) 3 CO 2 + 3 CH 4 (DG°’ = -390 k. J/mole) La bassa resa energetica della metanogenesi costringe i microrganismi coinvolti a cooperare molto efficientemente ed a stabilire relazione di “SINTROFIA” la cooperazione tra 2 organismi che dipendono l’uno dall’altro. La mutua dipendenza non può essere sostituita dall’aggiunta di nutrienti. Ad es. la cocoltura di Methanobacillus omelianskii degrada l’etanolo a: Strain S 2 CH 3 CH 2 OH + 2 H 2 O 2 CH 3 COO- + 2 H+ + 4 H 2 (DG°’ = +19 k. J per 2 mol of ethanol) Strain M. o. H. 4 H 2 + CO 2 CH 4 + 2 H 2 O (DG°’ = -131 k. J per mol of methane) Co-Culture 2 CH 3 CH 2 OH + CO 2 2 CH 3 COO- + 2 H+ + CH 4 (DG°’ = -112 k. J per mol of methane)

Obligate syntrophy between an acetogen and a methanogen is common Each species (e. g. , a methanogen and an acetogen) requires the other: the acetogen provides the hydrogen; the methanogen prevents a buildup of hydrogen (which inhibits the acetogens)

METANOGENESI: RESE ENERGETICHE E SINTROFIA Un processo che favorisce la sintrofia è il TRASFERIMENTO INTERSPECIE DI H 2, HCOO- E CH 3 COOin cui un efficiente “scavenger” per questi substrati (es. metanogeni o solfatoriduttori) ne mantiene una bassa concentrazione, favorendone la produzione da parte degli acetogeni sintrofici

Fermentazione Glucosio + 4 H 2 O -> 2 acetato + 2 HCO 3 - + 4 H+ + 4 H 2 DG=-207 k. J mol-1 // -319 k. J mol-1 2 Etanolo + 2 H 2 O -> 2 acetato + 2 HCO 3 - + 2 H+ + 4 H 2 DG=+19, 4 k. J mol-1 // -37 k. J mol-1 Metanogenesi 4 H 2 + HCO 3 - + H+ -> CH 4 + 3 H 2 O DG=-136 k. J mol-1 // -3, 2 k. J mol-1 Acetogenesi 4 H 2 + 2 HCO 3 - + H+ -> acetato + 4 H 2 O DG=-105 k. J mol-1 // -7, 1 k. J mol-1 Sintrofia Condizioni standard // In acqua dolce CH 4, 0. 6 atm; H 2, 10 -4 atm

What happens to all this methane? Diffusive transport up into oxic zone – aerobic methane oxidation Bubble ebullition (in shallow seds, with strong temperature or pressure cycles) followed by oxidation in atmosphere Anaerobic methane oxidation coupled to sulfate reduction Gas hydrate formation

Degradazione anaerobica del metano in sedimenti marini SO 42 - + 4 H 2 + H+ -> HS- + 4 H 2 O DG=-156 k. J mol-1 Inverso della metanogenesi CH 4 + 2 H 2 O -> CO 2 + 4 H 2 DG=+131 k. J mol-1 Totale: SO 42 - + CH 4 -> HCO 3 - +HS- + H 2 O

Used fluorescent probes to label, image aggregates of archaea (methanogens, red) and sulfate reducers (green) in sediments from Hydrate Ridge (OR) – observed very tight spatial coupling. Boetius et al. , 2000

(CH 2 O)n Fotosintesi Batteri chemolitotrofi Respirazione Metanotrofi +O 2 CH 4 CO 2 -O 2 Metanogeni Batteri fototrofi Respirazione anaerobica Fermentazione (CH 2 O)n

Low T + high P + adequate gas (methane, trace other HC, CO 2) => gas hydrate Why do we care about methane hydrates? Resource potential Fluid flow on margins Slope destabilization / slope failure Chemosynthetic biological communities Climate impact potential

1 m 3 hydrate => 184 m 3 gas + 0. 8 m 3 water DIC = 980 Terr bio = 830 Peat = 500 Atm = 3. 5 Mar bio = 3 Total fossil fuel = 5000 x 1015 g. C total hydrate = 10, 000 x 1015 g. C (a guess!)

METANOGENESI: I REATTORI PER REFLUI • Reattori a biomassa libera • Reattori a biomassa adesa Migliore contatto tra le cellule e migliore sintrofia (es. la rimozione dell’H 2 prodotto dagli acetogeni sintrofici, Sintrophomonas e Sintrophobacter, da parte dei metanogeni idrogenotrofi che agiscono da “scavenger” dell’H 2 tossico per gli acetogeni) Stabilità della biomassa nel reattore (basso “washout” cellulare) Reattori UASB (upflow anaerobic sludge bed) Reattori a letto fisso espanso fluidizzato Strati di microrganismi La biomassa è organizzata in biofilm autoimmobilizzato in granuli compatti (diam. 0. 1 -1 cm) ad alta sedimentabilità Materiale di supporto Le cellule sono immobilizzate in un biofilm adeso ad un supporto inerte (plastica, legno, ecc. )

METANOGENESI: I REATTORI UASB Biogas Ricircolo Effluente Influente MESOFILI TERMOFILI

The ribosome is the site of translation of messenger RNA into protein. It is composed of two subunits. In prokaryotes, the large subunit is called 50 S and the small subunit is called 30 S. The 30 S subunit consists of a single strand of RNA (the 16 S r. RNA, 1542 bases), and 21 proteins ranging in molecular weight from 9 k. D to 61 k. D. The 30 S subunit can exist independently from the 50 S subunit and be reconstituted from its components in vitro. The 30 S subunit is the site of translation initiation. An understanding of its structure is useful for understanding the mechanisms of protein translation, and perhaps for designing drugs to modify these mechanisms. DGGE: elettoforesi su gel in gradiente denaturante

idrogenasi rid. 2 eformil-MFR deidrogenasi Fe-S, MPTdinucleotide, Mo enzima di membrana – diverse subunità formil-H 4 MPT metenil-H 4 MPT idrogenasi rid. (b-e) enzimi solubili, 1 subunità, senza gruppi prostetici 2 emetilene-H 4 MPT idrogenasi rid. 2 emetil-H 4 MPT Metil-H 4 MPT: Co. Mtransferasi Fe-S, corrinoide, di membrana metil-S-Co. M Eterodisolfuro riduttasi 2 e- metil-S-Co. M reduttasi 3 subunità, F 430=nichel tetrapirrolo