Cromatografia a Lquido Parte 1 Princpios Fases estacionrias

Cromatografia a Líquido – Parte 1 Princípios, Fases estacionárias e Instrumentação • D. C. Harris, Análise Química Quantitativa, 8ª Edição, Cap. 23 • Skoog, West, Holler, Crouch, Fundamentos de Química Analítica, tradução da 8ª edição Americana, Thompson, cap. 32

Cromatografia a Líquido 1964 – J. Calvin Giddings, Comparison of theoretical limit separation in gas and liquid chromatography, Analytical Chemistry 36 (1964) 1890. Previu que se pudesse utilizar partículas muito pequenas e usar o fluxo sob alta pressão, haveria um grande aumento do número de pratos e, portanto, no poder de resolução. 1966 – Horvath e Lipsky na Universidade de Yale constroem o primeiro cromatógrafo a líquido de alta pressão e cunham o nome High Pressure Liquid Chromatography – HPLC (CLAE em português). Década de 1970 – século XXI - Desenvolvimento da tecnologia de produção de pequenas partículas de silica silanizadas que permitem alto desempenho de resolução de misturas por HPLC.

Cromatografia a Líquido Injeção da Amostra Sistema de bombeamento Fase móvel: Líquido Fase Estacionária: Reservatórios de Solventes Sólido, ou Líquido suportado em fase sólida

Cromatografia a Líquido ©Gary Christian, Analytical Chemistry, https: //www. youtube. com/watch? v=f. OL 6 yh. GT 1 h. A. (Fernando Lopes) 6 th Ed. (Wiley)

Cromatografia a Líquido Princípios A distribuição de solutos entre a fase estacionária e a fase móvel em cromatografia a líquido tradicional é grandemente controlada por difusão. Difusão em líquidos é extremamente lenta quando comparada com gases. Para minimizar a difusão e o tempo de movimento dos solutos entre a fase móvel e os sítios de interação da fase estacionária, os critérios a seguir deves ser seguidos:

Cromatografia a Líquido Princípios 1 – O material empacotado na coluna deve ser finamente dividido e ter alta regularidade esférica para permitir empacotamento denso e homogêneo. 2 - A fase estacionária deve ter a forma de um filme fino e uniforme. Filmes com espessura < que 1 µm são os ideais. 3 – Quanto mais uniforme é o filme e o tamanho das partículas, mais eficiente será a coluna.

Cromatografia a Líquido Princípios

Cromatografia a Líquido Princípios Em baixas velocidades de fluxo, a difusão molecular (termo B) se torna apreciável, causando aumento de H Qto menor o tamanho da partícula, menor é a dependência de H com relação a velocidade de fluxo, ou vazão ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6 th Ed. (Wiley)

Cromatografia a Líquido Princípios H = (2 a 3) x dp; dp = tamanho médio de partículas. Típico em HPLC Número de pratos teóricos em função da velocidade linear de fluxo para diferentes tamanhos de partículas em uma coluna de 10 cm de comprimento. ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6 th Ed. (Wiley)

Cromatografia a Líquido Princípios Cromatogramas obtidos com uma coluna de 5 cm de comprimento e mesma velocidade linear de fluxo Usando fase móvel com maior poder de eluição Pressão em (b) e (c) >>> (a)

HPLC – Fases Estacionárias Partículas microporosas, permeáveis ao solvente, são as mais comuns em HPLC. São disponíveis como a sílica pura (Si. O 2) para cromatografia de adsorção, ou com fase ligada – em muitos casos para cromatografia de partição. Partículas esféricas de silica porosa com diâmetro de 10 m – Tamanho típico de poros = 100 Å. Aumento de 800 X ©Gary Christian, Analytical Chemistry, 6 th Ed. (Wiley)

HPLC – Fases Estacionárias Tipos estruturais de partículas usadas em HPLC Solutos difundem na fase móvel estagnada nos poros das partículas (3 – 10 m) Com partículas de 1, 5 a 2, 5 m – alta eficiência com impedância hidrodinâmica, requer mais alta pressão Possuem uma mistura de poros grandes e pequenos – permitem alta vazão e trabalho com moléculas grandes – proteínas (3 -10 m) Partículas não-porosas (1, 5 a 2, 5 m). Não possuem fase móvel estagnada – Rápida transferência de fase – separações rápidas – não requer tanta pressão como nas partículas totalmente porosas

Partícula superficialmente porosa

Eficiência em função da velocidade linear de fluxo e tamanho das partículas Evoluções mais recentes – século XXI Velocidade linear (mm/s)

HPLC – Fases Estacionárias Cromatografia - Diferentes formas de separação - Cromatografia de partição (fase reversa ou fase reversa) - Cromatografia iônica - Cromatografia por exclusão - Cromatografia em gel

HPLC – Fases Estacionárias Sílica – um suporte adequado para funcionalização - Grupos silanóis

HPLC – Fases Estacionárias Modificação de superfície da sílica para interações hidrofóbicas – cromatografia líquida em fase reversa Grupo Polar R= CH 3 ; Grupo apolar (C 8) (C 18)

HPLC – Fases Estacionárias Cromatografia em Fase Reversa Ver Fig 24 -7 Harris, 8 th Ed. Silanois residuais Evita um mecanismo de interação secundário com os silanóis residuais

HPLC – Fases Estacionárias Retenção por interação hidrofóbica – cromatografia em Fase Reversa Forças de van der Waals e dispersão Energia: ~ 20 k. J/mol – análoga a extração líquido de água

HPLC – Fases Estacionárias Outros grupos são usados para funcionalizar a sílica Para fase reversa pode-se usar ainda C 8, C 4, grupos fenílicos …. . E para fase normal, troca iônica, etc. ?

HPLC – Fases Estacionárias Fase Normal em partículas de sílica

HPLC – Fases Estacionárias Fase Normal Interações polares: • Ligações hidrogênio • Dipolo - dipolo • Dipolo – dipolo induzido • Interações π-π

HPLC – Fases Estacionárias Interações iônicas Trocadores catiônicos Trocadores aniônicos

HPLC – Fases Estacionárias Suportes de Sílica Vantagens: Desvantagens: Versatilidade química Baixa estabilidade química frente meios ácidos e básicos Estabilidade Mecânica Elevada área superficial Limites: 2, 5 < p. H < 7, 5 Baixo custo Atualmente existem materiais poliméricos e híbridos orgânicos – inorgânicos que trabalham em p. H na faixa de 1 a 13 (ver Fig. 24 -8 Harris 8 th ed. )

Componentes de um HPLC Queda de Pressão na coluna Pressão Reservatório(s) de Solvente(s) Bomba(s) Injetor Coluna Detector Solventes: • Alta pureza (grau HPLC), Filtrados • Devem ser miscíveis • Compatíveis com ampla faixa de p. H • Devem ser deaerados com gás de alta pureza (He), ou sob vácuo – evitar aparecimento de bolhas

Componentes de um HPLC Bomba Reciprocante Sistemas pode ter bombas com 1 ou 2 pistões, ou ainda 2 bombas para variar a composição da fase móvel – gradiente de polaridade Requerimentos: • Pressões de até 6000 psi (lb/pol 2); 15000 psi para partículas porosas com diâmetro de 1, 7 m • Livre de pulsação – requer o “pulse damper” • Vazões de 0, 1 a 10 m. L min-1 • Variações de vazão de no máximo 0, 5% • Resistência a corrosão por grande variedade de solventes

Componentes de um HPLC Válvula de injeção Dimensões do “loop” definem o volume de amostra; 10, 25, 50, 100 L Volume de amostra injetado é bastante reprodutivel

Componentes de um HPLC Pré-coluna Discos de titânio Retém as partículas Coluna HPLC com uma pré-coluna substituível para coletar as impurezas que são adsorvidas irreversivelmente. Discos de titânio sinterisado distribuem o líquido uniformemente sobre todo o diâmetro da coluna.

Componentes de um HPLC Colunas Típicas: Coluna preparativa • Feitas em aço inox, PEEK • Diâmetro interno – 1 a 4, 6 mm • Comprimento: 2, 5 a 25 cm • Para uma coluna de 15 cm, 4, 6 mm de d. i. e partículas de 5 m – 9. 000 pratos ; para partículas de 3 m temse ~ 15. 000 pratos Nano-LC 50 – 100 m d. i.

Componentes de um HPLC, DETECTORES: FUNÇÃO: Gerar um sinal transiente que permite identificar e quantificar a substância de interesse que está sendo eluída da coluna. IMPORTANTE: Não há um detector universal. → A escolha do detector é ditada pela natureza da amostra. CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS: - Alta sensibilidade e baixo limite de detecção. - Pequeno Volume – deve-se minimizar todos os volumes extra coluna - Ser de fácil operação e robusto. - Resposta rápida

Componentes de um HPLC - Detectores HPLC Detector Commercially Available Mass LOD (Commercial detectors) Mass LOD (State of art) Absorbance Yes 100 pg – 1 ng 1 pg Fluorescence Yes 1 -10 pg 10 fg Electrochemical Yes 10 pg – 1 ng 100 fg Refractive Index Yes 100 ng – 1 µg 10 ng Conductivity Yes 500 pg – 1 ng 500 ng Mass Spectrometry Yes 100 pg – 1 ng 1 pg FT-IR Yes 1 µg 100 ng Light Scattering Yes 10 µg 500 ng Optical Activity No - 1 ng Element Selective No - 10 ng Photoionization No - 1 pg – 1 ng

Componentes de um HPLC Detectores Exemplo de cela de fluxo para medidas de absorbância na região do UV/Vis Exemplo de cela de fluxo para medidas de fluorescência

Representação esquemática de detectores espectrofotométrico e eletroquímico (A célula eletroquímica abaixo dá mais detalhes)

HPLC – Detecção Amperométrica

Resumo • Cromatografia a Líquido: • Princípios • Fases estacionárias • Sílica como um suporte para diversos mecanismos de retenção • Componentes de um equipamento de cromatografia a líquido