Protemica Cromatografia Prof Dr Luciano Pinto Cromatografia 1903

Proteômica Cromatografia Prof. Dr. Luciano Pinto

Cromatografia -1903: Mikhail Sémionovitch Tswett (1872 -1919) • Chroma + graphein = cor + escrita

Definição • Método fisico-químico de separação de substâncias • Presença de duas fases: Estacionária e móvel • Separação ocorre devido a diferença de interação entre as substâncias e as fases • Podendo ser uma analise qualitativa e/ou quantitativa Cromatografia em papel

Tipos de cromatografia

Cromatografia por exclusão molecular gel filtração • A fase estacionária (matriz) consiste num gel com poros de diferentes tamanhos • Recolha das proteínas de menor massa que entretanto percorreram o ‘caminho’ dos poros • • Separa moléculas de diferentes tamanhos Resina usada – SEPHADEX, SUPERDEX – polímero de glicose- gel formado por esferas com poros Proteínas menores entram nos poros e as maiores são “excluídas” saindo primeiro na coluna

Gel Filtração

Característica da Matriz Superdex

Típica cromatografia de gel filtração

Cromatografia de afinidade • Resina usada AGAROSE- polímero de açucares de algas ao qual se liga um composto pelo qual a proteína tenha afinidade – enzima - o ligante é o seu substrato; – anticorpo - o ligante é o antígeno; – receptor de hormônio - ligante é o hormônio; • É a mais específica de todas.

Tipo de cromatografia de afinidade • Pode ter o antígeno ligado • Pode ter o anticorpo ligado

Cromatografia de troca iônica • Resina usada - CELULOSE ligada covalentemente a grupos com carga positiva ou negativa – carboximetilcelulose (- negativa) – dietilaminoetilcelulose (+ positiva) • Proteínas com a mesma carga da resina saem primeiro da coluna • Moléculas carregadas ligam-se a grupos de carga oposta que se situam na matriz • Remoção das proteínas que se ligaram à matriz é feita alterando as características do meio

Troca iônica: adsorção das moléculas

Troca iônica : eluição das moléculas

Troca iônica: eluição das moléculas e equilíbrio da coluna

Cromatógrafos Análise em escala laboratorial- pequenas purificações

Cromatógrafos

Cromatógrafos

Colunas de cromatografia

Purificação seqüencial: Típica Aplicação • Captura e purificação de: • Proteínas, ex. : – Anticorpos monoclonais – Sangue/ fatores do plasma – Proteínas recombinantes • • Peptídeos Polissacarídeos Oligonucleotídeos Vírus Diferentes tipos de colunas em linha