Cromatografia 1 Il termine cromatografia indica un insieme

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Cromatografia 1. Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche hanno lo scopo di

Cromatografia 1. Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo 2. Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi 1. FASE STAZIONARIA immobilizzata che può essere un solido, un gel, un liquido o una miscela solido/liquido 2. FASE MOBILE che fluisce in continuo attraverso la fase fissa e può essere liquida o gassosa.

Nascita della cromatografia • inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di

Nascita della cromatografia • inizi del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett. • Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella foglia; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata con carbonato di calcio ed eluì, (cioè versò in continuo) con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla Tswett chiamò questa tecnica cromatografia dal greco scrittura del colore

Coefficiente di distribuzione 1. È alla base di tutte le tecniche cromatografiche 2. Definisce

Coefficiente di distribuzione 1. È alla base di tutte le tecniche cromatografiche 2. Definisce come un composto si distribuisce tra due fasi non miscibili. Date due fasi non miscibili A e B, il valore di questo coefficiente ad una data temperatura è costante ed è rappresentato dalla seguente espressione: [campione] nella fase A (mobile) Kd = [campione] nella fase B (stazionaria) 3. Ogni sostanza ha un suo caratteristico valore di Kd che la identifica in modo univoco.

Tipi di cromatografia Le separazioni cromatografiche possono essere eseguite secondo due modalità differenti: 1.

Tipi di cromatografia Le separazioni cromatografiche possono essere eseguite secondo due modalità differenti: 1. CROMATOGRAFIA SU COLONNA: • la fase stazionaria è impaccata in una colonna di vetro o metallo. • La fase mobile viene fatta fluire attraverso la colonna mediante gravità, l’uso di una pompa o di un gas ad alta pressione e gli analiti si separano in base al loro Kd ed escono dalla colonna separati nella fase mobile. • È il metodo d’uso più comune nella biochimica analitica

Cromatografia su colonna Il flusso della fase mobile entro la colonna può avvenire semplicemente

Cromatografia su colonna Il flusso della fase mobile entro la colonna può avvenire semplicemente per effetto della gravità oppure per azione di una pompa peristaltica.

Tipi di cromatografia 2. CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE: La fase stazionaria è generalmente uno

Tipi di cromatografia 2. CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE: La fase stazionaria è generalmente uno strato dallo spessore uniforme di circa 1 mm di materiale adsorbente, depositato su una lastra di vetro. Il materiale adsorbente può essere gel di silice, allumina, cellulosa in polvere a seconda dell'applicazione richiesta. La fase mobile è un solvente opportunamente scelto (o una miscela di solventi), capace di separare i componenti della miscela da analizzare e poco affine per polarità alla fase stazionaria scelta. Per effetto di capillarità il solvente sale lungo la lastrina, trascinando con sé in maniera differente i componenti della miscela e separandoli.

IL CROMATOGRAMMA Le separazioni cromatografiche strumentali si concludono con la registrazione del cromatogramma E’

IL CROMATOGRAMMA Le separazioni cromatografiche strumentali si concludono con la registrazione del cromatogramma E’ il tracciato che descrive l’andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo o del volume di eluente a partire dall’istante in cui la miscela viene introdotta nella colonna (t=0).

Visualizzazione della separazione Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del

Visualizzazione della separazione Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluito (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si può ottenere un cromatogramma

IL CROMATOGRAMMA • • • Al passaggio del solo eluente il segnale è bassissimo,

IL CROMATOGRAMMA • • • Al passaggio del solo eluente il segnale è bassissimo, quindi avremo la linea di base. Al passaggio delle sostanze in esame il segnale è amplificato ed il tracciato si inclina, raggiunge un massimo e ritorna alla linea di base. Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco cromatografico. • In condizioni cromatografiche ideali il picco cromatografico ha la forma di una curva gaussiana. • Da un punto di vista matematico una curva gaussiana viene descritta dal punto di massimo e dalla distanza tra i punti di flesso (tale distanza diviso 2 è la deviazione std. ( )

IL PICCO CROMATOGRAFICO Altezza del picco: distanza tra il punto massimo e la tangente

IL PICCO CROMATOGRAFICO Altezza del picco: distanza tra il punto massimo e la tangente alla linea di base Larghezza della base del picco (W): lunghezza del segmento interpolato all’intersezione fra le tangenti ai flessi della gaussiana e la linea di base (Wb = 4 ) Larghezza a metà altezza: larghezza misurata a metà altezza del picco (WH = 2. 354 ) Area totale sottesa: proporzionale alla concentrazione

TEMPO DI RITENZIONE (t. R): tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad

TEMPO DI RITENZIONE (t. R): tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse: 1. il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t. M 2. il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t. R > t. M

RISOLUZIONE DEL PICCO Il successo di una separazione cromatografica viene valutato in base alla

RISOLUZIONE DEL PICCO Il successo di una separazione cromatografica viene valutato in base alla capacità del processo cromatografico di risolvere il picco di un analita da un altro, cioè di separare un determinato composto dagli altri componenti della miscela. 1. La risoluzione indica il grado di separazione dei picchi e dipende dalla selettività ed efficienza. 2. In termini matematici la risoluzione tra due picchi adiacenti (Rs) è espressa dal rapporto fra le loro distanze e la semisomma delle rispettive larghezze alla base

Il valore minimo di Rs è di 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%). Rs=

Il valore minimo di Rs è di 1 (sovrapposizione dei picchi del 4%). Rs= 1. 5 (sovrapposizione dello 0. 3%) la separazione è considerata completa.

Selettività 1. è la capacità di un sistema cromatografico di eliminare specie chimiche diverse

Selettività 1. è la capacità di un sistema cromatografico di eliminare specie chimiche diverse a velocità il più possibile diverse in modo che siano l’una separata dall’altra. è espressa dal fattore dì selettività a che può essere considerato come il rapporto tra i tempi di ritenzione per i 2 analiti:

Efficienza è la capacità di un sistema di eliminare tutte le particelle di una

Efficienza è la capacità di un sistema di eliminare tutte le particelle di una stessa sostanza con la stessa velocità in modo da avere picchi stretti. Picchi alti e stretti

Efficienza 1. L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna si

Efficienza 1. L'efficienza di un sistema cromatografico e in particolare di una colonna si quantifica con il cosiddetto numero di piatti teorici N. 2. Le colonne cromatografiche possono immaginarsi costituite da un certo numero di zone adiacenti in ognuna delle quali c’è spazio a sufficienza affinché il soluto raggiunga un completo equilibramento tra fase mobile e stazionaria. Ciascuna regione è detta PIATTO TEORICO (una colonna è fatta da N piatti teorici). N Piatto teorico 3. Un piatto teorico è la più piccola zona adiacente all'interno della colonna in cui il soluto raggiunge un equilibrio tra fase mobile e stazionaria. 4. N si calcola considerando la larghezza del picco; più stretti sono i picchi, più efficiente è la colonna. Piatto teorico

La lunghezza della colonna che corrisponde ad un piatto teorico è detta ALTEZZZA EQUIVALENTE

La lunghezza della colonna che corrisponde ad un piatto teorico è detta ALTEZZZA EQUIVALENTE DEL PIATTO TEORICO, H. migliore è una colonna: • maggiore è il numero di piatti teorici e • minore l’altezza del piatto teorico.

Equazione di van Deemter I principi che descrivono l'efficienza cromatografica si possono riassumere nell'equazione

Equazione di van Deemter I principi che descrivono l'efficienza cromatografica si possono riassumere nell'equazione di van Deemter, che esprime l'altezza del piatto teorico (H) in funzione della velocità di flusso della fase mobile (V). Minore è il valore di H, maggiore è il numero di piatti teorici contenuti nella colonna e quindi maggiore sarà la sua efficienza. A = percorsi alternativi B = diffusione longitudinale C = tempo di equilibramento m= velocità di flusso A, B, C fenomeni che rallentano il raggiungimento dell’equilibrio

H L'equazione di Van Deemter è in realtà la somma di tre diverse equazioni,

H L'equazione di Van Deemter è in realtà la somma di tre diverse equazioni, ognuna delle quali fornisce un contributo alla determinazione di H: 1. Cammini multipli (diffusione espressa dal termine A microvorticosa), H=A Come si vede A non dipende dalla velocità del carrier ma solo dall'uniformità dimensionale delle particelle del riempimento. Per rendere minimo A e quindi H (aumentando così il numero N di piatti teorici e quindi l'efficienza della colonna) è necessario migliorare l'uniformità dell'impaccamento

H 2. Diffusione molecolare longitudinale, espressa dal termine B: H=B/m H e m sono

H 2. Diffusione molecolare longitudinale, espressa dal termine B: H=B/m H e m sono inversamente proporzionali: • una bassa velocità di flusso aumenterà il fenomeno della diffusione molecolare longitudinale aumentando H e quindi diminuendo l’efficienza della colonna, • una elevata velocità di flusso ridurrà H migliorando l’efficienza perché tenderà a mantenere compatta la banda di migrazione non dando alle molecole il tempo di diffondere longitudinalmente

3. Resistenza al trasferimento di massa, espressa dal termine C: dipende dal fatto che

3. Resistenza al trasferimento di massa, espressa dal termine C: dipende dal fatto che l'equilibrio tra fase fissa e fase mobile non è istantaneo ma richiede un certo tempo; quindi le molecole eluite si muovono verso l'uscita più velocemente nel carrier gassoso che nel liquido di ripartizione: ne consegue un certo "ritardo" nel trasferimento di massa tra le due fasi, che “deforma” la banda molecolare di migrazione H H=C*m m e H sono direttamente proporzionali • una elevata velocità di flusso aumenta H riducendo il numero di piatti teorici e peggiorando l’efficienza della colonna; • una ridotta velocità di flusso riduce H perché deforma in modo meno netto la banda di migrazione, aumentando l’efficienza della colonna a causa dell’aumento del numero dei piatti teorici.

L'andamento complessivo è espresso dalla curva risultante dalla somma dei 3 contributi. H il

L'andamento complessivo è espresso dalla curva risultante dalla somma dei 3 contributi. H il valore ottimale di velocità media di flusso del carrier è quello corrispondente al minimo della curva complessiva, in quanto per un valore di H minimo si ha il massimo numero di piatti teorici N e quindi si rende massima l'efficienza della colonna, cioè la capacità di separare i componenti della miscela analitica.

Asimmetria dei picchi cromatografici I picchi cromatografici possono avere una forma gaussiana non simmetrica.

Asimmetria dei picchi cromatografici I picchi cromatografici possono avere una forma gaussiana non simmetrica. Si possono avere due tipi di deformazioni: 1. FRONTING. Quando si osserva un incremento graduale nella porzione frontale del picco seguito da un rapido declino. La causa più comune è il caricamento eccessivo di campione sulla colonna. 2. TAILING: nel caso in cui la salita del picco è normale ma la coda si protrae. In genere si verifica perché l’analita viene trattenuto sulla fase stazionaria da alcuni siti attivi che adsorbono le molecole di analita con elevata affinità e le rilasciano lentamente.

Il fattore di simmetria viene espresso dal fattore o rapporto di asimmetria: As= b/a

Il fattore di simmetria viene espresso dal fattore o rapporto di asimmetria: As= b/a a e b sono le distanze della curva dalla verticale tracciata nel punto di massimo del picco, misurate in corrispondenza del 10% dell’altezza del picco, rispettivamente a sinistra e destra del punto massimo. Nel caso di tailing As>1 nel caso di fronting As<1.

Meccanismi della separazione • Il successo di una separazione cromatografica dipende dalla scelta della

Meccanismi della separazione • Il successo di una separazione cromatografica dipende dalla scelta della fase stazionaria e di quella mobile che deve essere effettuata di modo che i composti da separare abbiano diversi coefficienti di distribuzione • Tipi di cromatografia: Cromatografia Proprietà Gel filtrazione Dimensioni e forma Scambio ionico carica Interazione idrofobica idrofobicità Affinità Interazione con un ligando

Gel filtrazione 1. Consente la separazione di molecole sulla base alle loro dimensioni e

Gel filtrazione 1. Consente la separazione di molecole sulla base alle loro dimensioni e forma (più esattamente in base al loro raggio di Stokes, raggio effettivo di una molecola se gira rapidamente su se stessa). 2. Sfrutta le proprietà di setaccio molecolare di una varietà di materiali porosi. 3. Nessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proteine. 4. GF is a non-binding method, so buffer composition does not directly affect separation. This means that separation can be performed in the presence of buffer additives, and within a broad p. H and ionic strength. GF gives you the flexibility to choose chromatography conditions that are optimal for your sample and requirements for further purification

Gel filtrazione 1. I materiali usati di solito a questo scopo sono polimeri presenti

Gel filtrazione 1. I materiali usati di solito a questo scopo sono polimeri presenti sotto forma di un reticolo tridimensionale poroso che conferisce loro proprietà di gel. 2. Da qui il termine di gel-filtrazione per descrivere la cromatografia che utilizza questi materiali. FASE STAZIONARIA: granuli con pori di dimensioni controllate FASE MOBILE: liquida

Gel filtrazione: principio generale La cromatografia ad esclusione si fonda su un principio abbastanza

Gel filtrazione: principio generale La cromatografia ad esclusione si fonda su un principio abbastanza semplice: una colonna di particelle di gel è in equilibrio con un solvente adatto alle molecole da separare. Volume vuoto Spazio tra i granuli Volume interno spazio all’interno dei granuli Volume totale la somma del volume vuoto e volume interno Volume di eluizione Volume con cui viene eluita una determinata molecola

Le molecole più grandi che non possono passare attraverso i pori sono escluse dai

Le molecole più grandi che non possono passare attraverso i pori sono escluse dai granuli e sono ristrette ai vuoti esterni eluendo dopo che è passata una quantità di fase mobile uguale al Volume vuoto o escluso Vo che è lo spazio fra i granuli.

Le molecole con pieno accesso ai pori si muovono lungo la colonna ma non

Le molecole con pieno accesso ai pori si muovono lungo la colonna ma non si separano tra loro. Queste molecole eluiscono ad un volume totale Vt che è la somma di Vo e Vi (spazio all’interno dei granuli). Le molecole con un parziale accesso ai pori della matrice eluiscono dalla colonna secondo dimensioni decrescenti con un Volume di eluizione Ve e sono dette parzialmente incluse.

Tipico cromatogramma

Tipico cromatogramma

Gel filtrazione Per un dato tipo di gel il coefficiente di distribuzione, Kd, di

Gel filtrazione Per un dato tipo di gel il coefficiente di distribuzione, Kd, di un particolare analita tra la fase mobile interna ed esterna è funzione delle sue dimensioni molecolari. • • Se una molecola di analita è grande ed è completamente esclusa dalla fase mobile presente all’interno del gel, il suo Kd = 0 se l’analita è sufficientemente piccolo da avere completo accesso alla fase mobile interna il suo Kd = 1

Materiali per matrici Una matrice deve avere: 1. Alta stabilità meccanica permettere buone velocità

Materiali per matrici Una matrice deve avere: 1. Alta stabilità meccanica permettere buone velocità di flusso e per ridurre al minimo la caduta di pressione lungo la colonna; 2. Buona stabilità chimica; 3. Gruppi funzionali per facilitare il legame della fase stazionaria; 4. Elevata capacità, ossia densità dei gruppi funzionali per minimizzare il volume di letto; 5. Disponibilità di particelle di una serie di dimensioni; inoltre alcuni tipi di cromatografie richiedono una matrice a struttura porosa, nel qual casi i pori devono essere della misura e della forma corretta. 6. Una superficie chimicamente inerte per ridurre al minimo l’adsorbimento non selettivo degli analiti e quindi evitare il fenomeno del tailing

Materiali per gel filtrazione

Materiali per gel filtrazione

Materiali per matrici AGAROSIO • L’agarosio è un polisaccaride purificato dall’agar-agar, una sostanza gelatinosa

Materiali per matrici AGAROSIO • L’agarosio è un polisaccaride purificato dall’agar-agar, una sostanza gelatinosa isolata a sua volta dalle alghe. • È un polimero lineare e neutro formato da catene del disaccaride AGAROBIOSIO (unità di D-galattosio e di 3, 6 -anidro-L-galattosio) legate alternativamente con legami glicosidici. • L’agarosio è uno zucchero solubile in acqua alla temperatura di ebollizione, mentre diventa solido mano che si raffredda formando un gel grazie alla formazione di una matrice tridimensionale costituitasi attraverso dei legami a idrogeno tra le catene lineari. • Queste matrici possiedono buone proprietà di flusso ed elevata idrofilicità ma per evitare cambiamenti irreversibili non dovrebbero mai essere lasciate seccare. • Esempi commerciali: Sepharose.

Materiali per matrici DESTRANO • polisaccaride composto di unità di glucosio legate mediante legami

Materiali per matrici DESTRANO • polisaccaride composto di unità di glucosio legate mediante legami a-1 -6. • Quando viene usata come matrice presenta legami crociati formati con epicloridrina; • rispetto alle matrici di cellulosa è meno stabile all’idrolisi acida. È stabile fino p. H 12 ed è idrofilico. • Esempi commerciali: Sephadex

Reidratazione (swelling) della resina Queste matrici funzionano sotto forma di gel idratato, ma spesso

Reidratazione (swelling) della resina Queste matrici funzionano sotto forma di gel idratato, ma spesso sono vendute sotto forma di polvere secca, che deve essere idratata prima di impaccare la colonna. L’idratazione si ottiene in genere mescolando una parte di polvere con dieci di soluzione tamponata, e lasciando che la matrice assorba tampone per parecchie ore, mescolando di tanto in tanto.

Impaccamento della colonna Si ottiene sospendendo la matrice in tampone ed aggiungendola delicatamente all’interno

Impaccamento della colonna Si ottiene sospendendo la matrice in tampone ed aggiungendola delicatamente all’interno della colonna. Il rubinetto d’uscita deve essere aperto, così che ci sia flusso di liquido nella colonna mentre la resina decanta e si assesta (dopo avere versato tutta la matrice, si continua ad aggiungere tampone). E’ importante effettuare l’impaccamento in un’unica fase ed evitare di intrappolare bolle d’aria nel gel, per evitare variazioni nella uniformità della matrice.

Applicazioni della gel filtrazione Purificazione la principale applicazione della cromatografia a esclusione è la

Applicazioni della gel filtrazione Purificazione la principale applicazione della cromatografia a esclusione è la purificazione delle macromolecole biologiche. le molecole di interesse devono cadere entro l’intervallo di separazione dello specifico gel usato, quindi per scegliere una certa matrice per la purificazione bisogna avere un’idea preliminare delle dimensioni o del peso molecolare della particella. Con questa tecnica si possono purificare proteine (di solito si usa come ultimo passaggio in un protocollo di purificazione), anticorpi, acidi nucleici (ad es. , plasmidi), polisaccaridi ed anche virus.

Allontanamento dei Sali • • si possono separare soluti ad alto peso molecolare dai

Allontanamento dei Sali • • si possono separare soluti ad alto peso molecolare dai sali o dai solventi organici usando colonne impaccate con una resina per gel filtrazione a pori piccoli (ad es. , una Sephadex G-25; il limite di esclusione del gel deve essere inferiore alle dimensioni della macromolecola d’interesse). Infatti, mentre le macromolecole vengono eluite con il volume vuoto, i sali, a basso peso molecolare, vengono trattenuti dalla matrice. Questo metodo di dissalazione è più rapido ed efficiente di quello per dialisi

Determinazione del peso molecolare di una proteina sconosciuta • il tempo di ritenzione per

Determinazione del peso molecolare di una proteina sconosciuta • il tempo di ritenzione per le proteine globulari dipende dalle dimensioni e quindi dalla massa molecolare. • Per una data colonna, i tempi di ritenzione di diverse proteine globulari dipendono linearmente dalla massa delle proteine stesse (almeno per certi intervalli di valori di massa). Una volta calibrata la colonna con proteine globulari di massa nota, è possibile dedurre con buona approssimazione la massa ignota di una proteina globulare dal suo tempo di ritenzione.

Analisi della struttura quaternaria Risoluzione di monomeri proteici quando questi, per le condizioni del

Analisi della struttura quaternaria Risoluzione di monomeri proteici quando questi, per le condizioni del mezzo, sono organizzati in dimeri o aggregati

Tempo. . Inizio della dialisi Equilibrio

Tempo. . Inizio della dialisi Equilibrio

1. Nella pratica, la dialisi viene spesso effettuata chiudendo la soluzione proteica entro un

1. Nella pratica, la dialisi viene spesso effettuata chiudendo la soluzione proteica entro un tubino di membrana semipermeabile chiuso alle due estremità. Il sacchetto così ottenuto viene poi immerso in un contenitore contenente un largo eccesso di soluzione diluita. 2. La soluzione esterna viene mantenuta in agitazione con un agitatore magnetico per accelerare un po’ i tempi di dialisi. 3. Dopo alcune ore, la soluzione esterna può essere sostituita con soluzione fresca, per favorire un’ulteriore rimozione di piccole molecole dal sacchetto. Soluzione proteica Agitatore magnetico

Cromatografia a scambio ionico 1. Si basa sull’interazione elettrostatica tra particelle di carica opposta

Cromatografia a scambio ionico 1. Si basa sull’interazione elettrostatica tra particelle di carica opposta 2. Numerose sostanze biologiche, ad esempio gli aminoacidi e le proteine, possiedono gruppi ionizzabili che possono portare una carica positiva o negativa.

Cromatografia a scambio ionico La carica netta di questi composti è dipendente dal loro

Cromatografia a scambio ionico La carica netta di questi composti è dipendente dal loro p. Ka e dal p. H della soluzione in accordo con l’equazione di Henderson-Hasselbach.

Cromatografia a scambio ionico • Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne

Cromatografia a scambio ionico • Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne impaccate con una resina scambiatrice di ioni. • Si tratta di una resina in cui una matrice solida di supporto, in forma di sferule porose porta covalentemente legati dei gruppi funzionali carichi.

Scambiatori ionici 1. Sono materiali insolubili che, se portati a contatto con una soluzione,

Scambiatori ionici 1. Sono materiali insolubili che, se portati a contatto con una soluzione, hanno la proprietà di scambiare gli ioni inizialmente legati ad essi con gli ioni presenti in soluzione. 2. I gruppi ionizzabili dissociano in ioni fissi che rimangono legati alla matrice e ioni liberi o contro-ioni, di segno opposto a quello dei gruppi legati, che passano in soluzione. 3. Questi contro-ioni possono scambiarsi con qualsiasi ione dello stesso segno presente in soluzione.

Scambiatori ionici Scambiatore cationico: • possiedono gruppi funzionali acidi che quando dissociano lasciano sulla

Scambiatori ionici Scambiatore cationico: • possiedono gruppi funzionali acidi che quando dissociano lasciano sulla matrice un residuo con carica negativa e liberano un catione come contro-ione. • attraggono cationi carichi positivamente. • I gruppi funzionali acidi più comuni sono i gruppi solfonici e carbossilici

Scambiatori ionici Scambiatore anionico • possiedono gruppi funzionali basici che quando dissociano lasciano sulla

Scambiatori ionici Scambiatore anionico • possiedono gruppi funzionali basici che quando dissociano lasciano sulla matrice un residuo con carica positiva e liberano un anione come contro-ione. • Attraggono anioni carichi negativamente • I gruppi funzionali basici più comuni sono i gruppi amminici

Strong Exchangers stay ionized as p. H varies between 2 and 12. Weak exchangers

Strong Exchangers stay ionized as p. H varies between 2 and 12. Weak exchangers can lose ionization as a function of p. H.

Meccanismo di scambio ionico Low ionic strength buffer

Meccanismo di scambio ionico Low ionic strength buffer

Adsorbimento 1. Dipende dalla carica della proteina 2. La carica dipende dal p. I

Adsorbimento 1. Dipende dalla carica della proteina 2. La carica dipende dal p. I della proteina e dal p. H

Eluizione 1. Nella cromatografia a scambio ionico, l’interazione tra proteina e fase stazionaria dipende

Eluizione 1. Nella cromatografia a scambio ionico, l’interazione tra proteina e fase stazionaria dipende • dalla carica della proteina che, come detto, dipende a sua volta dal p. H; • Dalla forza ionica della fase mobile. Più alta la forza ionica, maggiore la competizione degli ioni in soluzione con la proteina. 2. Generalmente sono usati gradienti di • p. H: variazione della carica delle molecole comporta il distacco dallo scambiatore (varia la protonazione/deprotonazione dei gruppi carichi responsabili del legame conseguente indebolimento dell’interazione con la matrice stessa) • forza ionica: competizione per lo scambiatore tra ioni e molecole analizzate (aumentando la concentrazione di sale )

The higher the net charge, the stronger the adsorption and the higher the salt

The higher the net charge, the stronger the adsorption and the higher the salt concentration needed to desorb the sample molecule.

Eluizione ELUIZIONE ISOCRATICA: 1. si usa lo stesso tampone dall’inizio alla fine 2. È

Eluizione ELUIZIONE ISOCRATICA: 1. si usa lo stesso tampone dall’inizio alla fine 2. È usata raramente nella IEX ELUIZIONE IN GRADIENTE 1. usato molto frequentemente 2. I gradienti di Sali sono formati mescolando 2 eluenti, uno contenente una bassa concentrazione del sale (buffer A) e l’altro una più alta (buffer B). 3. i sistemi cromatografici generalmente controllano la formazione di gradiente tramite l’utilizzo di 2 pompe, una per il buffer A e una per il B

Eluizione Ci sono 2 modalità di eluizione in gradiente: 1. Gradiente continuo 2. Gradiente

Eluizione Ci sono 2 modalità di eluizione in gradiente: 1. Gradiente continuo 2. Gradiente a scalini

GRADIENTE CONTINUO: 1. transizione del gradiente è lineare crescente (continua e lineare variazione di

GRADIENTE CONTINUO: 1. transizione del gradiente è lineare crescente (continua e lineare variazione di concentrazione). 2. Le proteine legate debolmente escono per prime, quelle legate più fortemente per ultime.

GRADIENTE A GRADINI: 1. permette di lavorare nel range di gradiente, se noto, a

GRADIENTE A GRADINI: 1. permette di lavorare nel range di gradiente, se noto, a cui si ha l’eluizione della proteina di interesse.

The distance between peaks is controlled by the slope of the gradient The shallower

The distance between peaks is controlled by the slope of the gradient The shallower the gradient, the greater the distance between the peaks.

Cromatografia a scambio ionico • L'efficienza della cromatografia a scambio ionico non è strettamente

Cromatografia a scambio ionico • L'efficienza della cromatografia a scambio ionico non è strettamente legata al volume di campione applicato alla colonna e quindi possiamo caricare sulla colonna volumi anche elevati di campioni. • Questa tecnica cromatografica ha notevole importanza perché permette di separare proteine che hanno una differenza di carica molto piccola (0. 5 o poco più di punto isoelettrico).

Scambiatori ionici Il tipo di scambiatore da usare dipende ovviamente dal punto isoelettrico (p.

Scambiatori ionici Il tipo di scambiatore da usare dipende ovviamente dal punto isoelettrico (p. I) di una proteina, nonché dalla sua stabilità in funzione del p. H. Se una proteina è stabile al di sopra del suo p. I, conviene lavorare sopra il p. I ed usare uno scambiatore anionico; se la proteina è stabile al di sotto del suo p. I, conviene lavorare a basso p. H ed usare uno scambio cationico. Un suggerimento è di lavorare ad un p. H distante circa 1 unità dal p. I – questo consente di avere una carica netta sufficiente per favorire l’adsorbimento, senza richiedere però condizioni troppo drastiche per l’eluizione.

Charge properties of proteins and peptides 1. Protein and peptide net charges depend on

Charge properties of proteins and peptides 1. Protein and peptide net charges depend on their contents of charged amino acids. These carry weak acidic or amino groups and the net charge is therefore a function of p. H.

La carica netta di una proteina varia a seconda del p. H del tampone:

La carica netta di una proteina varia a seconda del p. H del tampone: 1. Se p. I proteina è > p. H buffer scambiatore cationico 2. Se p. I proteina è < p. H buffer scambiatore anionico la proteina si legherà a uno

La cromatografia a scambio ionico delle proteine Esempio • Cromatografia a scambio anionico •

La cromatografia a scambio ionico delle proteine Esempio • Cromatografia a scambio anionico • Tre proteine: A: p. I = 5, B: p. I = 6, C: p. I = 7 • Tampone p. H = 8 SAX + + + + + A Interazione forte 3° ad eluire B Interazione media 2° ad eluire C Interazione debole 1° ad eluire

Cromatografia ad interazione idrofobica (HIC) 1. È un tipo di cromatografia sviluppato per la

Cromatografia ad interazione idrofobica (HIC) 1. È un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine che vengono separate sulla base della loro idrofobicità di superficie. 2. I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate. 3. le proteine tendono così ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni così esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.

Hydrophilic means "loves water" and is assigned to molecules that readily interact with water

Hydrophilic means "loves water" and is assigned to molecules that readily interact with water through dipole-dipole interaction or by hydrogen bonding. Hydrophobic means "hates water" and is assigned to molecules that do not interact with water. There is no sharp boundary between hydrophilic and hydrophobic but rather a continuum of hydrophobicity (or hydrophilicity for that matter)

Vantaggi della HIC

Vantaggi della HIC

Fattori che influenzano la HIC 1. Tipo di ligando Le interazioni possono non essere

Fattori che influenzano la HIC 1. Tipo di ligando Le interazioni possono non essere strettamente idrofobiche. I ligandi alchilici hanno carattere idrofobico puro mentre con ligandi arilici sono possibili interazioni aromatiche e idrofobiche 2. Grado di sostituzione la capacità di legame delle proteina alla HIC aumenta con l’aumentare della lunghezza della catena alchilica e aumentando il grado di sostituzione del ligando immobilizzato. 3. Tipo e concentrazione di sale i Sali che producono un maggiore salting out (Na, K o ammonio solfato) effettivamente promuovono le interazioni ligandoproteina. La quantità di proteina legata aumenta linearmente con l’aumento della concentrazione di sale

Fattori che influenzano la HIC 4. p. H in generale un aumento di p.

Fattori che influenzano la HIC 4. p. H in generale un aumento di p. H indebolisce le interazioni idrofobiche 5. Temperatura il legame delle proteine alla HIC è guidato dall’entropia quindi le interazioni idrofobiche aumentano con l’aumento della temperatura 6. Additivi alcoli e detergenti (non polari) possono competere con la proteina per i siti sulla HIC

In this example, all the proteins interact with the hydrophobic surface of the HIC

In this example, all the proteins interact with the hydrophobic surface of the HIC medium, but, as the ionic strength of the buffer is reduced, the interaction is reversed and the protein with the lowest degree of hydrophobicity is eluted first. The most hydrophobic protein elutes last, requiring a greater reduction in salt concentration to reverse the interaction.

Cromatografia di affinità 1. La purificazione tramite cromatografia di affinità non si basa sulle

Cromatografia di affinità 1. La purificazione tramite cromatografia di affinità non si basa sulle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche. 2. Separa le proteine sulla base dell’interazione reversibile tra una proteina (o un gruppo di proteine) e uno specifico ligando immobilizzato sulla matrice cromatografica.

Cromatografia di affinità • Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato

Cromatografia di affinità • Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice. La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna. Le altre proteine vengono “lavate” via. • Per questo la cromatografia d'affinità è in grado, almeno in teoria, di raggiungere una purificazione completa in una singola tappa, anche partendo da miscele complesse. La tecnica è quasi esclusivamente preparativa e necessita di accurate conoscenze sulla struttura e sulla reattività della molecola da separare, tali da permettere la scelta di un giusto ligando.

Cromatografia di affinità Il binding (adsorbimento) e l’eluizione (desorbimento) di una proteina target (T)

Cromatografia di affinità Il binding (adsorbimento) e l’eluizione (desorbimento) di una proteina target (T) a e da un ligando (L) può essere considerato in termini di equilibrio di legame e di cinetica di adsorbimento e desorbimento. La costante di dissociazione per il complesso ligando-target dovrebbe idealmente essere nel range di 10 -4 -10 -8 M

Componenti di un mezzo di affinità MATRICE: per l’accoppiamento del ligando. La matrice dovrebbe

Componenti di un mezzo di affinità MATRICE: per l’accoppiamento del ligando. La matrice dovrebbe essere chimicamente e fisicamente inerte. BRACCIO SPAZIATORE: usato per migliorare il legame tra il ligando e la molecola target di modo da evitare effetti di ingombro sterico (di solito tra i 6 -8 atomi di C). LIGANDO: molecola che si lega reversibilmente ad una molecola target specifica o ad un gruppo di proteine target. Matrice Braccio spaziatore Ligando

CARATTERISTICHE DEL LIGANDO Il ligando deve 1. essere compatibile con i solventi usati durante

CARATTERISTICHE DEL LIGANDO Il ligando deve 1. essere compatibile con i solventi usati durante la procedura di accoppiamento 2. Possedere almeno un gruppo funzionale tramite il quale possa essere immobilizzato sulla matrice. Gruppi usati comunemente sono gruppi: • amino, • carboxyl, • aldehyde , • thiol, and • hydroxyl groups. 3. Il gruppo funzionale usato per il legame alla matrice NON deve essere essenziale per le proprietà di legame del ligando alla proteina target.

SPACER ARM: 1. An affinity adsorbent might show poor function due to low sterical

SPACER ARM: 1. An affinity adsorbent might show poor function due to low sterical availability of the ligand. The use of a "spacer arm" in many cases solves this problem. 2. Hydrocarbon chains of five to ten carbons are frequently used. 3. Care must be taken to ensure that the spacer does not contribute to nonspecific binding through ionic or hydrophobic interactions.

Steps in affinity chromatography 1. 2. Il mezzo viene equilibrato con binding buffer Il

Steps in affinity chromatography 1. 2. Il mezzo viene equilibrato con binding buffer Il campione è applicato in condizioni che favoriscono il legame specifico della molecola target al ligando. Le molecole target si legano specificamente ma in maniera reversibile e il materiale non legato viene lavato attraverso la colonna.

Steps in affinity chromatography 3. 4. La proteina target legata è recuperata cambiando le

Steps in affinity chromatography 3. 4. La proteina target legata è recuperata cambiando le condizioni che favoriscono la sua eluizione. L’eluizione può essere specifica, usando un ligando competitivo, o non-specifica, cambiando il p. H, la forza ionica o la polarità. La proteina target viene raccolta in forma pura. Il mezzo viene riequilibrato con binding buffer.

Metodi di eluizione nella cromatografia di affinità Metodo 1 Caso più semplice. Un cambiamento

Metodi di eluizione nella cromatografia di affinità Metodo 1 Caso più semplice. Un cambiamento nella composizione del buffer eluisce le sostanze legate senza danneggiare sia la sostanza che il ligando. Metodo 2 Sono richiesti per l’eluizione valori estremi di p. H o alte concentrazioni di agenti caotropici. Queste condizioni tuttavia possono causare danni permanenti o temporanei. Metodo 3 -4 Utilizzo di eluizione specifiche tramite aggiunta di sostanze che competono per il legame.

Tipico cromatogramma

Tipico cromatogramma

Cromatografia di affinità 1. Molti componenti possono essere usati come ligandi per purificare I

Cromatografia di affinità 1. Molti componenti possono essere usati come ligandi per purificare I loro rispettivi partner di legame. 2. Alcune tipiche interazioni frequentemente usate nella cromatografia di affinità sono:

Immunocromatografia 1. anticorpi monoclonali immobilizzati su matrice solida. 2. Le interazioni sono molto stabili

Immunocromatografia 1. anticorpi monoclonali immobilizzati su matrice solida. 2. Le interazioni sono molto stabili (le costanti di dissociazione dei complessi antigene/anticorpo sono dell’ordine di 10 -12 - 10 -8 M). Seppure ciò comporti la necessità di usare condizioni molto energiche per recuperare la proteina di interesse, il vantaggio che deriva dall’uso di anticorpi altamente specifici consiste nella elevata qualità del processo di purificazione.

Immunocromatografia 1. Con tecniche di cromatografia di affinità vengono generalmente purificati anche le immunoglobuline

Immunocromatografia 1. Con tecniche di cromatografia di affinità vengono generalmente purificati anche le immunoglobuline G. a. vengono immobilizzate alla matrice solida proteina A o proteina G che hanno una grande affinità per la regione costante delle Ig. G. Queste proteine, immobilizzate su una matrice solida, legano quindi fortemente le Ig. G a p. H fisiologico. b. Le Ig. G possono essere recuperate semplicemente abbassando il p. H della fase mobile (è generalmente necessario portare il p. H a valori inferiori a 3). c. Per evitare la denaturazione delle Ig. G recuperate in condizioni acide, gli eluati devono venir raccolti in una soluzione tampone che riporti velocemente il p. H al valore fisiologico.

Purificazione di glicoproteine • La concanavalina A (Con. A), una proteina che interagisce fortemente

Purificazione di glicoproteine • La concanavalina A (Con. A), una proteina che interagisce fortemente con residui di glucosio e mannosio, è la lectina maggiormente usata in proteomica, in quanto le glicoproteine animali presentano frequentemente residui di mannosio legati covalentemente a specifici siti della sequenza amminoacidica in seguito a modificazioni post-traduzionali (funzionali al processo di escrezione dalle cellule eucariote). • Eluizione specifica con i monosaccaridi o gli oligosaccaridi per i quali la lectina è specifica. • In alternativa, il legame delle glicoproteine con la lectina possono essere scissi mediante riduzione del p. H.

Recombinant fusion proteins

Recombinant fusion proteins

Recombinant fusion proteins 1. La purificazione di proteine ricombinanti può spesso essere semplificata incorporando

Recombinant fusion proteins 1. La purificazione di proteine ricombinanti può spesso essere semplificata incorporando un tag di lunghezza nota nella proteina. GST tag