Tema 18 Ingeniera Gentica 1 GENMICA Y PROTEMICA

Tema 18 Ingeniería Genética

1. GENÓMICA Y PROTEÓMICA • GENÓMICA - CONCEPTO. Parte de la biología que se encarga de conocer el genoma completo, sus funciones y las interacciones entre unos genes y otros. - USOS Identificar los genes que codifican las proteínas. Comprender la forma en que interactúan unos genes con otros. Comparación de genes de distintas especies para estudios evolutivos.

• PROTEÓMICA - - CONCEPTO. Se encarga de estudiar el proteoma o conjunto de proteínas codificadas por el ADN celular en determinados momentos y condiciones. USOS. Estudio de las proteínas. Estudio de las técnicas de extracción de las proteínas de un tejido. Técnicas de separación y cuantificación Análisis e identificación de las proteínas

2. PROYECTO GENOMA HUMANO( PG 274) Es un proyecto que persigue secuenciar el genoma o secuencia de nucleótidos del ADN humano, para elaborar mapas y conocer los genes codificantes. • CONCLUSIONES Existen entre 20. 000 y 25. 000 genes que codifican proteínas Sólo el 1, 5% del ADN codifica proteínas el resto se conoce como ADN basura, que se cree presenta un papel regulador. Los seres humanos son idénticos en el 99, 9%. Nos diferenciamos en un 0, 1% , que son unos 3 millones de nucleótidos. La mayoría de las diferencias se encuentran en las variaciones de un solo nucleótido Nos diferenciamos del chimpancé solo en un 1% del genoma.

3. INGENIERÍA GENÉTICA. BIOTECNOLOGÍA(261) CONCEPTO: Conjunto de técnicas utilizadas para modificar el ADN de un organismo con un objetivo concreto. Se un gen seleccionado a un vector de clonación para introducirlo en la célula huésped, que fabricará la proteína del gen insertado. Todas las células descendientes de ella portarán dicho gen. PROCESO GENERAL. 1º Se prepara el gen que se quiere clonar utilizando endonucleasas de restricción (son unas enzimas que cortan el ADN en lugares concretos, se aislaron en bacterias que las usan como protección ante infecciones). 2º Preparar el vector de clonación con la misma enzima( trocito de ADN que se pretende introducir). 3º Formar el ADN recombinante con la enzima ADN ligasa que une los fragmentos. 4º Replicación del ADN recombinante en la célula huésped. 5º Propagar el cultivo induciendo la división celular. 6º Seleccionar los clones recombinantes con los marcadores que posee ( se suelen marcar con fluorescencia o radioactividad).

4. TÉCNICAS DE I. GENÉTICA(262) • TECNOLOGÍA ADN RECOMBINANTE. - CONCEPTO: Consiste en cortar el ADN en fragmentos concretos y luego unir ese fragmento a otro ADN, formando una única molécula denominada ADN recombinante o transgen. - ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN. Son enzimas aisladas de bacterias que reconocen lugares específicos del ADN (secuencias palindrómicas) en las que rompen el enlace fosfodiester y separan los fragmentos de ADN. El corte no siempre es simétrico, quedando fragmentos monocatenarios, denominados extremos pegajosos o cohesivos. ( escalonado)

- PROCESO. Se selecciona el fragmento de ADN que se quiere obtener, por medio de las endonucleasas de restricción y se cortan. Una vez obtenidos los fragmentos de ADN deseados se insertan en el ADN huésped, mediante la ADN ligasa y se obtiene el ADN recombinante.

• RENATURALIZACIÓN E HIBRIDACIÓN DEL ADN(263) Se somete el ADN a p. H superiores a 12 o a temperaturas de 100º, el ADN se desnaturaliza al romperse los puentes de hidrógeno. Posteriormente se mantienen unas condiciones de 65º durante un tiempo y las hebras de ADN pueden renaturalizarse. Si lo hacen e hibridan nos indica que las hebras tienen mucha similitud, cuanto más hibriden mas complementarias son.

- USOS. Detectar secuencias complementarias. Localizar genes relacionados con distintas poblaciones. Insulina humana y gorila. Detectar enfermedades genéticas por alteraciones de la secuencia de ADN.

• VECTORES DE CLONACIÓN(264) - CONCEPTO Y CARACTERÍSTICAS . Consiste en generar múltiples copias de un Gen o fragmento de ADN en el interior de un organismo que funciona como hospedador. Generalmente se usa procarionte aunque excepcionalmente se pueden usar eucariontes como algunas levaduras. Características de los organismos hospedadores -Deben ser capaces de replicarse independientemente junto con el ADN que transportan, crecer rápido en un medio barato ( para obtener muchas copias y no aumentar mucho los precios) -No debe ser patógeno y aceptar ADN exógeno y permanecer estable un tiempo -Debe favorecer la entrada del trasgen. -Contener un sítio de corte por enzimas de restricción. -Tener algún marcador para ser reconocido. - Organismos del que se tenga un amplio conocimiento como Escherichia coli.

TIPOS DE VECTORES PLÁSMIDOS. Son pequeñas moléculas de ADN circular bacteriano que se replican independientemente del cromosoma bacteriano, son estables durante su aislamiento químico, se manipulan fácilmente y presenta marcadores que facilita su detección, como la resistencia a antibióticos.

VIRUS Se aprovecha su capacidad de parasitar a las células. Se utilizan bacteriófagos, que parasitan a bacterias , retrovirus y adenovirus que parasitan a células eucariontes. A veces algunos genes de la célula huésped pueden incorporarse al genoma del virus. Si este virus parasita a otra célula le puede transferir los genes de la primera. CÓSMIDOS. Son híbridos contruidos con parte de un cromosoma del fago y de ADN de un plásmido. La ventaja frente a los plásmidos es que puede transportar una porción de ADN mucho mayor.

• TÉCNICA DEL PCR( reacción en cadena de la polimerasa 267) - - En 1986 se desarrolló la técnica reacción en cadena de la polimerasa, que permite obtener muchos fragmentos de ADN sin necesidad de células. Es importante cuando se tiene una muestra muy pequeña de ADN y se necesitan muchos fragmentos para investigar. PROCESO. Desnaturalización por calor del ADN en cadenas sencillas. Hibridación de unos cebadores sintéticos que tienen cada uno la secuencia complementaria de uno de los extremos de la cadena de ADN La ADN polimerasa alarga la cadena, a partir de los cebadores en sentido 5´- 3´ por adición de nucleótidos a la muestra USOS Medicina forense a partir de ADN encontrado en la escena de un crimen (sangre, pelo, semen. . ) Franmentos de ADN antiguos. Mamuts congelados, homínidos, momias , insectos en ambar. ADN de células embrionarias, para diagnóstico prenatal. ADN de genes virales para detección de algunos patógenos dificiles de detectar como VIH.

• SECUENCIACIÓN DEL ADN(268) Este método de secuenciación fue diseñado por Frederick Sanger. Se denomina método didesoxi porque se emplean nucleótidos que no tienen grupo OH en el carbono 3´del azúcar. Para realizar este procedimiento se necesita: - Muchas copias del ADN que se quiere secuenciar - Cebadores - ADN polimerasa - Desoxirribonucleótidos - Didesoxirribonucleótidos (marcados con fluorescencia) Se van añadiendo nucleótidos para formar la cadena complementaria a la cadena molde que se quiere secuenciar. La síntesis de estas cadenas se detiene cuando se añade un dideoxi-nucleótido. Se obtienen cadenas de diferentes longitudes de manera que, las más cortas son las que se mueven más rápido a través de un gel de poliacrilamida. Mediante un detector de fluorescencia se van detectando los diferentes nucleótidos didesoxi marcados, pudiendo determinar así cuál es la secuencia de bases del ADN que se está determinando.

Secuenciación de ADN. Método de Sanger.

• IDENTIFICAR ADN RECOMBINANTE( Pg 266) Para localizar el ADN recombinante construido previamente dentro de una genoteca ( un grupo o colección de genes grande) se utilizan sondas, que son pequeños oligonucleótidos unos 20 nucleótidos de cadena sencilla que se hibridan con cualquier ADN recombinante que tenga la secuencia complementaria a la que presente. Esta sonda se puede marcar radiactivamente o fluorescentemente. Se puede obtener sintéticamente si se conoce el gen o la secuencia de proteína. Es muy importante para seleccionar bacterias o células después de haber realizado un experimento de clonación.

5. CLONACIÓN DEL ADN • CLONACIÓN. (265) Producir múltiples copias de un gen específico o un fragmento de ADN en el interior de un organismo que hace las veces de huésped. • PROCESO. Se insertan los genes marcadores en un plásmido. Con enzimas de restricción se rompe el plásmido y el ADN humano. Se dejan un tiempo para que se integre ADN humano en los plásmidos con la ayuda de la ADN ligasa, formándose un ADN recombinante. Se mezclan los plásmidos con bacterias ( E. coli) y las bacterias incorporarán el plásmido recombinante. Se cultivan las bacterias, para obtener numerosas muestras de ADN recombinante. Ejemplo: La producción de insulina humana.

6. Aplicaciones de la I. G. (270) • MÉDICAS – FABRICACIÓN PRODUCTOS FARMACEUTICOS Las proteínas se encuentra en cantidades pequeñas en los tejidos normales y su purificación es cara, por ello se utilizan microorganismos para su obtención. De esta forma se obtiene insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación, interferón Para la fabricación de insulina se obtienen los genes de las dos subunidades A y B o se sintetizan Estos genes se insertan en plásmidos de E. coli. A continuación los plásmidos recombinantes se introducen en bacterias E. coli, que fabrican las subunidades A y B. Posteriormente se renaturalizan y se organizan en una insulina activa.

-MEDICINA FORENSE Los seres humanos diferenciamos genéticamente sólo en el 0, 1% de nuestro ADN. Estas diferencias se encuentran en regiones concretas de cromosomas que son conocidas y se utilizan como marcadores. Estas diferencias se usan como huella genética. El método más utilizado es el de las repeticiones cortas en tandem. Son secuencias cortas de bases nitrogenadas que se repiten consecutivamente. Estas secuencias se repiten en todas las personas, pero es distinto en número de repeticiones. Cuantas más secuencias tandem se analicen, mayor precisión.

-DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES Se selecciona el gen causante de la enfermedad. Se puede utilizar la PCR, para hacer muchas copias de estudio. Se puede analizar el gen para detectar una posible mutación comparándolo con un gen correcto. También se puede realizar una hibridación del fragmento con una posible mutación , con un fragmento sano. Detectando muchas enfermedades antes de que se manifiesten los síntomas.

-TERAPIA GÉNICA. - Consiste en insertar un gen en las células de un paciente para corregir un defecto genético o para dotar a la célula de una nueva función. TERÁPIA GÉNICA EN CÉLULAS SOMÁTICAS. Puede ser in situ en el que se introducen genes directamente en los tejidos del paciente, pero no siempre llegan a entrar en las células. Por eso es más eficaz in vivo, en el que se introducen vía sanguínea el gen deseado en un vector , que introducen el gen en una célula diana y la línea germinal procedente de esta fabrica la proteína deseada.

También se realiza in vitro, que consiste en extraer células del enfermo, se cultivan y se les inserta el gen deseado y posteriormente se reintroducen en el organismo.

-TERAPIA GÉNICA EN CÉLULAS GERMINALES. Se debería hacer a nivel de gametos o célula huevo en su estado inicial. Esta se transmite a la descendencia pero tiene muchas limitaciones.

Se utiliza para enfermedades que se pueden extraer fácilmente las células, que se pueden manipular con facilidad y se cultivan sin dificultades ( hígado, médula, piel) La primera que se realizó fue para el déficit inmunitario combinado severo (SCID), causado por el déficit de la adenosinadesaminasa (ADA). En la que se utilizó un retrovirus como vector para insertar el gen correcto ADA en linfocitos del paciente. (niños burbuja)

- PRODUCCIÓN DE VACUNAS I. GENÉTICA Por ingeniería genética se clonan los genes de las proteínas de la cubierta vírica y se expresan en bacterias o virus no patógenos. Así se obtienen vacunas recombinantes seguras para reemplazar a las clásicas en las que se introducía el patógeno muerto o inactivo directamente. Se habla de vacuna subunidad cuando contiene una sola subunidad específica de una proteina de la cubierta del patógeno. La primera descubierta fue contra la hepatitis B( expresada en levaduras)

7. O. M. G. Los organismos modificados genéticamente O. M. G. son aquellos a los que se les ha alterado su material genético. Si se realiza en microorganismos se llaman organismos recombinantes y si es en plantas y animales organismos transgénicos. • ORGANISMOS RECOMBINANTES Son virus o bacterias modificados genéticamente. El primer organismo obtenido fue una bacteria de E. coli a la que se introdujo el gen que codificaba a la insulina humana

- PLANTAS TRANSGÉNICAS(272) Son plantas a las que se insertan genes para mejorar el producto, hacerlas resistentes a plagas, a la temperatura etc. Para el proceso se utiliza como vector el plásmido T 1 de Agrobacterium tumefaciens ( bacteria del suelo). Con las técnicas de la endonucleasa de restricción se introduce el gen deseado y se obtiene el plásmido recombinante. Posteriormente se introduce en células vegetales Hay un tipo de plantas transgénicas ( maiz, algodón, patata) portadoras de un gen Bt que proporciona resistencia a insectos parásitos. Se aisló de una bacteria del suelo ( Bacillus thiringiensis). Este gen produce unas proteinas que destruyen las células intestinales de los insectos. Maíz con el gen Bt resistente al insecto, maiz con un gen de un pez del Artico que es resistente a heladas, Patata rica en aminoácidos esenciales, arroz rico en vitamina A, tomates con maduración retardada. .

- ANIMALES TRANSGÉNICOS(273) - PROCESO 1) Construcción del transgen que contenga el gen deseado. 2) Transferencia del gen a las células, Existen dos métodos: Microinyección del ADN en el ovocito fecundado con un capilar fino. y se implantan los embriones en un útero nodriza. Microinyección del ADN en células embrionarias. Se seleccionan los individuos obtenidos portadores del gen deseado. 3) Detección de la proteína recombinante Al nacer los individuos se comprueba los que son transgénicos, que han incorporado el gen y lo expresan.

- TIPOS Animales obtenidos por la adición de genes de otra especie. Animales knock –out. En estos se inhibe la acción de un gen para comprobar los efectos que tiene como consecuencia de la inactivación. Animales obtenidos por clonación a partir de otros modificados genéticamente, generalmente por el proceso de transferencia nuclear

• CLONACIÓN Obtención de organismos genéticamente idénticos entre sí y al original. Por disgregación de células embrionarias y cada célula funciona como un embrión. Por transferencia nuclear: 1º Se obtiene una célula somática de un individuo. 2º. Se toma un ovocito, se retira su núcleo y se le incorpora el interior de la célula somática. 3º. Se desarrolla la célula embrionaria. 4º. Se implanta en el útero de una hembra.

Por fusión nuclear: Se fusiona una célula completa del animal que se va a clonar con un óvulo de otro animal al que se le ha extraido el núcleo. Esta fusión genera un embrión que se implanta en una madre nodriza distinta.

OBTENCIÓN DE UN CERDO TRANSGÉNICO. Se aisla un gen humano que codifica a una proteína de interés. Se selecciona un promotor del gen de la caseina que se expresa sólo en las glandulas mamarias. Se introduce por microinyección en un óvulo fecundado de un cerdo y se obtiene un animal transgénico, que contiene en su leche la proteína humana deseada

8. APLICACIONES DE LOS OMG • BIOMEDICINA Para modelos de enfermedades genéticas humanas como anemia falciforme. Para estudiar el efecto de fármacos usando ratones knock –out. Producir órganos para trasplantes. Estudio de mutaciones que producen enfermedades. • INDUSTRIA FARMACÉUTICA. Producir proteínas recombinantes en la leche de animales , que se aislan y purifican, factores de crecimiento y coagulación. Fabricar hormonas, insulina y hormona del crecimiento. Producir vacunas hepatitis B, papiloma Producir interferón, anticuerpos

• MEDIO AMBIENTE Bacterias pseudomonas modificadas genéticamente que potencian la eliminación de los hidrocarburos en los vertidos. Biorremedación. Cianobacterias modificadas para degradar pesticidas. Bioadsorción: bacterias modificadas que fijan metales pesados en su cubierta • GANADERÍA Mejorar el producto de carne, leche con mayores valores nutricionales, o que contengan sustancias que se puedan aislar. Obtener peces de crecimiento rápido como el salmón. Salmones con el gen anticongelante. • AGRICULTURA. Plantas resistentes a heladas, a enfermedades y herbicidas. Plantas que detiene su maduración como los tomates. Producir insecticidas biológicos Arroz rico en vitaminas

9. BIOETICA En 1970 nace la bioética como aplicación de la ética a las ciencias de la vida. Pretende regular y evitar el mal uso de los avances Diagnóstico precoz de enfermedades incurables Modificaciones del genoma. Selección de embriones. Fabricación de animales y plantas transgénicas. Clonaciones Posibles problemas a evitar derivados de la ingeniería genética. -De carácter ecológico: posible hibridación de organismos modificados genéticamente con variedades silvestres y dispersión de genes que pueden producir efectos secundarios como contaminación de aguas. - Saniarios: Efectos sobre la salud del consumo de organismos modificados genéticamente. Ej. Fresas con genes de pescado, soja con nuez del brasil, puedn producir problemas de alergias alimenticias. -Sociales, éticos y legales; manejo de datos genéticos, patentar genes, selección de caracteres. https: //www. boe. es/boe/dias/2007/07/04/pdfs/A 28826 -28848. pdf

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