Cromatografia em Camada Delgada Discentes Daniely de Godoy

Cromatografia em Camada Delgada Discentes: Daniely de Godoy Silva Germano Blaquez Junior Gislaine Ap. da Cunha Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira Profª Amanda Coelho Danuello

Histórico da Cromatografia em Camada Delgada BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas de sais inorgânicos. Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a Cromatografia em Camada Delgada, para análise de produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os sólidos ao suporte. Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.

Cromatografia : Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.

Técnicas cromatográficas Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano Cromatografia em coluna: Fase estacionária permanece num tubo

Critério de classificação Planar Técnica Fase Móvel Líquido Fase Estacionária Líquido. Sólido Tipo de cromatografia CP CCD Coluna Gás Fase ligada CCD Líquido Sólido CGL CGS Líquido Fase Líquido Sólido ligada Fase ligada CGFL CLS CE CLFLCTI CB

Outra Classificação Fase Normal Polaridade: FE > FM > polaridade < polaridade FE utilizada : Sílica G Fase Reversa Polaridade: FE < FM FE utilizada: Sílica C 18 < polaridade > polaridade

MECANISMO DE AÇÃO ABSORÇÃO ADSORÇÃO

Mecanismos Adsorção Líquido/gás sólido Troca Iônica Líquido sólido + + + - Partição Líquido/gás Exclusão líquido Líquido/gás gel/sólido

FORÇAS INTERMOLECULARES MOLÉCULAS APOLARES Ex: Hidrocarbonetos FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON Molécula apolar Afastadas atração = Não existe Aproximação = Indução Dipolo instantâneo Atração

Dipolo - Dipolo Molécula polar sem H ligado a F, ou O ou N Moléculas Polares Ligação de Hidrogênio H ligado a F, ou O, ou N

Cromatografia em Camada Delgada Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície plana.

Aplicações: üEstudos preliminares da complexidade dos componentes de um extrato orgânico; üInvestigação de: Casos de envenenamento; ingestão de estimulantes por atletas; ü Estudos de reações : presença de intermediários estáveis; üAnálise da pureza de compostos; üAnálise da eficiência de: destilação e cristalização

Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada a. Simplicidade; b. Baixo custo; c. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o conteúdo de uma mancha ou de uma banda;

ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no adsorvente: Ausência de água = Adsorção Presença de água = Partição Exemplos de adsorventes: ØSílica-Gel ou àcido Silícico; ØÓxido de alumínio ou alumina; ØCelulose; ØKieselgur; Kieselgur Alumina ØPoliamida; Sílica gel

Sílica gel ou Ácido silícico Mais usada na CCD Substância porosa e amorfa. Apresenta caráter ácido. Possui característica polar, devido à presença de grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve apresentar número de hidroxilas razoável para ser seletivo na separação de substâncias de diferentes polaridades Mecanismo de adsorção: -Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H. -Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo Tratamento térmico eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de 105 a 110ºC) CUIDADO! A aspiração da sílica causa Caracterização do tipo básico de sílica gel : silicose, um tipo de inflamação G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante); pulmonar crônica! H: indica ausência de aglutinante; F: indica adição de substâncias fluorescentes; P: indica adsorvente para uso preparativo; R: indica adsorvente de alto grau de pureza; Preparação: 30 g de sílica com 60 -70 m. Lde água = 5 placas de 20 x 20 cm com espessura de 0, 3 mm

Sílica C 18 Usada em cromatografia de fase reversa, em que a fase estacionária é menos polar que a fase móvel

Alumina ou Óxido de Alumínio Segundo adsorvente mais empregado em CCD; Há três grupos deste adsorvente: ÁCIDA p. H 4, 0 BÁSICA p. H 9, 0 NEUTRA p. H 7, 0 Mecanismo de adsorção: Al 3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados) O 2 -: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+ A ativação da alumina faz-se, após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min. A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos. Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m 2. g-1. Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m 2. g-1. Preparação: 5 placas de 20 x 20 cm e espessura de 0, 3 mm, recomenda-se a utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 m. L de água destilada.

Celulose Existem dois tipos de celulose empregadas em CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose microcristalina. Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas aplicadas na CCD: Mecanismo: Partição ou troca iônica. Kieselgur ou terra de diatomáceas É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis. Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução. Poliamida Separação de fenóis e ácidos carboxílicos A separação depende da intesindade das forças decorrentes das ligações de hidrogênio com o analito. Baixa aderência ao vidro: dificuldade de preparação da placas

Técnica Geral Escolha da fase estacionária; Preparação das placas cromatográficas; Ativação das placas cromatográficas; Seleção da fase móvel; Aplicação das amostras nas cromatoplacas; Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma; Revelação dos cromatogramas; Documentação; Calculo do fator de retenção Rf;

Escolha da fase estacionária Liofilicidade e liofobicidade Interação com os componentes (polaridade) Necessidade de aditivos Aglutinantes Substâncias fluorescentes Capacidade adsorvedora

Preparação da placas As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à temperatura e uniformes. Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.

Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais reprodutíveis.

Procedimentos para a preparação das placas Limpeza da placa de vidro detergente e água corrente (eliminação de gordura); Secagem em estufa

Preparação das camadas finas dos adsorventes: Utilização de espalhadores ( mais empregada); Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do adsorvente apropriado.

Riscar as placas, determinando a altura de ínicio e fim da cromatografia

Ativação das placas Objetivo: retirar substâncias interferentes e eliminar água Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro. Exemplo : Sílica e alumina estufa 105 – 110 ºC por 30 – 60 min; Celulose estufa 105ºC por 10 min;

Seleção da fase móvel Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase móvel. Método de seleção Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto. Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.

Aplicação das amostras A amostra é aplicada na forma de solução 0, 1 – 1%, dependendo da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis possíveis. Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos capilares.

As amostras devem estar a mais ou menos 2, 0 cm da parte inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato direto com o solvente durante o desenvolvimento do cromatograma. Alinhamento horizontal uniforme.

Preparação da cuba A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso, coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação. A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera interna.

Desenvolvimento de um cromatograma numa cuba A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase móvel desejada

Revelação dos cromatogramas A- Procedimentos Físicos: Físicos Luz ultravioleta (aromáticos ou dupla ligação conjugada). B- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos: Enzimáticos Antibióticos, Enzimas e Substratos. C- Procedimentos Químicos: Químicos Aplicação de um reativo químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.

Reveladores Físicos Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes. Ex: clorofila.

Reveladores Químicos Iodo Ác. fosfomolibdico Anisaldeído Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis. Tipos de reveladores químicos Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato Flavonóides: NP-PEG Anti-oxidantes: β-caroteno Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de Ce. SO 4 Compostos fenólicos: Fe. Cl 3

Reveladores Biológicos Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para tornar a mancha visível. Ex. : para testar se uma amostra contém substância antifúngica, revela-se o cromatograma com esporos de fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas substâncias.

Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate factor) Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase móvel. Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a vírgula. Linha de chegada da FM dr 1 dr 2 dm Ws 1 Ws 2 Ponto de partida da amostra Profundidade da FM

Parâmetros Utilizados na Cromatografia Planar • Fartor de Retenção (Rf): • Rf = d r / d m • Resolução (Rs): • Rs = 2(dr 1 – dr 2) / (Ws 1 + Ws 2) • Eficiência: • n = 16 (dr – Ws)2

Desvantagens da CCD Difícil reprodutibilidade: quantidade de amostra aplicada obtenção de cromatoplacas com características idênticas. Dificuldade de detecção devido à difusão da amostra Difícil determinação exata do Rf.

Constantes Físicas

Bibliografia • COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed. Unicamp, Campinas, 1995. • NETTO, J. Z. , CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005 • THE MERCK INDEX, 13 th, ed. Merck & CO. , Inc. , Usa, 2001. • Labjeduardo. iq. unesp. br

Agradecimentos • Marquinho • Alberto Camilo Alécio • Amanda Coelho Danuello