Prof Valmir F Juliano QUI 624 INTRODUO AOS

Prof. Valmir F. Juliano QUI 624 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Classificação dos métodos analíticos CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS Chamados de métodos de via úmida Gravimetria Volumetria Baseados em propriedades físicas (químicas em alguns casos ) Eletroanalítico Cromatográfico Espectrométrico Propriedades elétricas Propriedades ópticas *Separação: interações físico-químicas. Propriedades mistas* Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.

Cromatografia Histórico Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903), botânico russo: Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e éter de solventes variados. petróleo mistura de pigmentos Ca. CO 3 pigmentos separados 1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)

Cromatografia Definição - Princípio Básico Cromatografia é um método físico-químico de separação de misturas, identificação e quantificação de seus componentes. • A separação depende da interação dos componentes da mistura com a fase móvel e com a fase estacionária. • A interação dos componentes da mistura com estas duas fases é influenciada por diferentes forças intermoleculares, incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de afinidade e solubilidade. • A identificação se dá mediante a comparação da interação de padrões com as fases estacionárias. • A quantificação é feita também pela comparação com padrões de concentrações conhecidas, através de curvas analíticas.

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com o sistema cromatográfico • Em Coluna • Cromatografia Líquida • Cromatografia Gasosa • Cromatografia Supercrítica • Planar • Centrífuga (Chromatotron®) • Cromatografia em Camada Delgada (CCD) • Cromatografia em Papel (CP)

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a fase móvel • Utilização de Gás • Cromatografia Gasosa (CG) • Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR) • Utilização de Líquido • Cromatografia Líquida Clássica (CLC) • Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) • Utilização de Gás Pressurizado • Cromatografia Supercrítica (CSC)

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas • De acordo com a Fase Estacionária • Líquida • Sólida • Quimicamente Ligadas • De acordo com o modo de separação • • Por Adsorção Por Partição Por Troca Iônica Por Afinidade

Cromatografia Classificação das técnicas cromatográficas Técnica Planar FM Líquido FE Líq Sól Coluna Gás Líq Sól Tipo de cromato- CP CCD CGL CGS grafia Líquido Líq Sól CLL CLS Troca Iônica Afinidade Fase Ligada Exclusão CTI CB CLFL CE

Cromatografia Analogia O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa região. Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as moscas e abelhas. Fase estacionária Analitos

Cromatografia Analogia Para uma mesma mistura, a simples troca da fase estacionária pode ser suficiente para alterar completamente a ordem de eluição de componentes da mistura. Fase estacionária Analitos

Cromatografia Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).

Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Fase estacionária líquida suportada na celulose. Fase móvel Separação A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos (líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.

Cromatografia em papel - CP A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa! Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Termos e parâmetros técnicos s c b a

Cromatografia de Camada Delgada - CCD FASES ESTACIONÁRIAS Sílica (Si. O 2) Alumina (Al 2 O 3) Celulose Poliamida Ativação de 30 a 60 min de 105 a 110 o. C Ativação de 10 min a 105 o. C

Cromatografia de Camada Delgada - CCD ANÁLISE QUALITATIVA - Comparação com valores de Rf tabelados - Comparação com padrão eluído em conjunto - Extração e aplicação de métodos instrumentais

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Conclusões: Amostra não contém a espécie B Amostra pode conter a espécie A Para se certificar da presença, eluir em outros solventes Amostra A B Após Eluição

Cromatografia de Camada Delgada - CCD Cromatografia Bi-dimensional Solvente 1 Solvente 2

Cromatografia planar Chromatotron é uma cromatografia de camada fina preparativa acelerada centrifugamente. Pode substituir pequenas colunas e HPLC.

Cromatografia em Coluna

Cromatografia em Coluna PROCESSOS DE SEPARAÇÃO Exclusão Partição Adsorção Troca Iônica Afinidade

Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO - Fase Móvel Líq. ou Gás - Fase Estacionária Sólida Processos de Adsorção/Dessorção Ligações de hidrogênio; Forças de Van der Waals

Cromatografia em Coluna Diferença entre Absorção e Adsorção

Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO Fase Estacionária Sólida: Polar Aumento da Atividade -CO 2 H > -OH > -NH 2 > -SH > -CHO > -C=O > -CO 2 R > -OCH 3 > -CH=CH-

Cromatografia em Coluna A função das fases móveis na cromatografia por adsorção tem sentido amplo: a) Função solvente • Solubilizar os componentes • Ter baixo ponto de ebulição b) Função eluente • Conduzir os componentes da mistura pela coluna • Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE) SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano < Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno < Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico < Acetato de Etila < Acetona < Etanol < Metanol < Ácido Acético

Cromatografia em Coluna ADSORÇÃO Usos: a) Laboratórios de química orgânica separar e purificar reagentes e materiais obtidos em síntese. b) Laboratórios de produtos naturais escala preparativa e analítica. c) Laboratórios de análises clínicas separação de esteróides de urina ou de sangue, etc.

Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO Fase Móvel Gasosa Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua volatilidade

Cromatografia em Coluna PARTIÇÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Líquida Processos de Solubilidade O processo de partição é intrafacial e a volta de cada componente para a fase móvel depende da sua solubilidade

Cromatografia em Coluna TROCA IÔNICA Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de extraordinário valor em processos analíticos. Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Processos de Troca Iônica Adsorção reversível e diferencial dos íons da fase móvel pelo grupo trocador da matriz

Cromatografia em Coluna Fluxo da FM TROCA IÔNICA Resinas Catiônicas e Aniônicas FE altamente carregada Maior Interação • Íons de alta carga • Íons de menor tamanho A diferença de afinidade entre os íons da FM pode ser controlada por p. H e força iônica

Cromatografia em Coluna O ajuste do p. H proporciona a separação das duas proteínas

Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Fase Móvel Líquida Fase Estacionária em Gel Enquanto as partículas menores penetram nas cavidades, as maiores vão sendo eluídas contornando as estruturas moleculares da FE.

Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão, introduzida por volta de 1960, de outros tipos de cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas, com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis. - Separação de tamanhos específicos - Separação de polímeros e proteínas - Determinação de Massa Molar

Cromatografia em Coluna EXCLUSÃO Características desejáveis para os Géis -Inércia Química: Não pode haver uma interação química entre a matriz e o soluto. -Estabilidade: O gel deve suportar uso contínuo quanto mantido em condições brandas de temperatura e p. H. -Baixo teor de íons: Grupos carregados interferem no processo de separação.

Cromatografia em Coluna Fluxo da FM EXCLUSÃO Tipos de Géis Dextrano (Sephadex) Poliacrilamida Ágar e Agarose

Cromatografia em Coluna AFINIDADE Fase Móvel Líquida Fase Estacionária Sólida Propriedades Biológicas e Funcionais

Cromatografia Teoria Básica Sem importância na CG, mas com grande importância na CLAE ⇌ ⇌ SOLUTO FASE MÓVEL ⇌ FASE ESTACIONÁRIA

Cromatografia Teoria Básica Coluna cromatográfica: cromatográfica série de estágios independentes onde acontece o equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase móvel: Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito sorvido na FE e dissolvido na FM. Afinidade pela FE [A]FE MENOR RETENÇÃO !!! KC = Constante de Distribuição [A]FE = concentração do analito na FE [A]FM = concentração do analito na FM Volatilidade [A]FM

Cromatografia Quantificação da eficiência Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM: Cada “estágio” de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO O número de pratos teóricos de uma coluna (N) pode ser calculado por: t. R wb N Coluna mais eficiente

Cromatografia Quantificação da eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) “Tamanho” de cada estágio de equilíbrio Valores típicos de H e N: (L = comprimento da coluna) Capilares, L = 30 m dc = diâmetro da coluna em mm df = espessura da fase estacionária em m Empacotadas, L = 2 m Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes

Cromatografia em fase gasosa Fase estacionária Detecção Fase móvel Separação

Cromatografia em fase gasosa Injetor: submetido à temperatura controlada Fase móvel: gás inerte Detector: submetido à temperatura controlada Coluna: contendo a fase estacionária está submetida à temperaturas controladas

Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG ? para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás. Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (=“evaporáveis”) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o. C e que sejam termicamente estáveis.

Cromatografia Gasosa Requisitos - Gás de arraste (FM) INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem com a fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO: Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: H 2 O, O 2 hidrocarbonetos oxida / hidrolisa algumas FE incompatíveis com DCE ruído no sinal de DIC

Cromatografia Gasosa CUSTO: Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. CUSTO Requisitos - Gás de arraste (FM) A B C A = 99, 995 % (4. 5) B = 99, 999 % (5. 0) C = 99, 9999 % (6. 0) PUREZA COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. Seleção de Gases de Arraste em Função do Detector: DCT He , H 2 DIC N 2 , H 2 DCE N 2 (SS), Ar + 5% CH 4

Cromatografia Gasosa Injetor Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANT NEA da amostra na coluna cromatográfica t = 0 Injeção instantânea: t = x t = 0 Injeção lenta: t = x

Cromatografia Gasosa Injetor “on column” 1 2 1 - Septo (silicone) 3 4 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica

Cromatografia Gasosa Injetor “on column” 1 2 3 1 - Ponta da agulha da microsseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantaneamente no início da coluna. 3 - “Plug” de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna.

Cromatografia Gasosa Parâmetros de injeção TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição. Regra Geral: Geral Tinj = 50 o. C acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil. VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra. Sólidos: Sólidos convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução Amostras Líquidas Amostras Gasosas empacotada = 3, 2 mm (1/4”) 0, 2 L. . . 20 L 0, 1 m. L. . . 50 m. L capilar = 0, 25 mm 0, 01 L. . . 3 L 1 L. . . 100 L COLUNA

Cromatografia Gasosa Microsseringas para injeção LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo agulha (inox 316) Microsseringa de 10 L: corpo (pirex) corpo agulha Microsseringa de 1 L (seção ampliada): guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia)

Cromatografia Gasosa Colunas EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0, 5 m a 5 m Recheada com sólido pulverizado (FE sólida ou FE líquida depositada sobre as partículas do recheio) CAPILAR = 0, 1 a 0, 5 mm L = 5 m a 100 m Paredes internas recobertas com um filme fino (fração de m) de FE líquida ou sólida

Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE VAPOR (p 0). Estrutura química do analito p 0 = f Temperatura da coluna Pressão de vapor ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENÇÃO) RETENÇÃO Velocidade de migração

Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA CONTROLE CONFIÁVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA É ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAÇÃO EM CG

Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: TCOL BAIXA: TCOL ALTA: - Componentes mais voláteis são separados - Componentes mais voláteis não separados - Componentes menos voláteis demoram a eluir, saindo como picos mal definidos - Componentes menos voláteis eluem mais rapidamente

Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura TEMPERATURA A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: TFIM R TINI t. INI Consegue-se boa separação dos componentes da amostra em menor tempo TEMPO t. FIM TINI - Temperatura Inicial TFIM - Temperatura Final t. INI - Tempo Isotérmico Inicial t. FIM - Tempo Final do Programa R - Velocidade de Aquecimento

Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura a) Isotérmico a 45 ºC; b) isotérmico a 145 °C; c) programado de 30 ºC a 180 ºC

Cromatografia Gasosa Programação linear de temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE: A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. DERIVA (“DRIFT”) NA LINHA DE BASE: Devido ao aumento de volatilização de FE líquida viscosidade vazão

Cromatografia Gasosa Fase Estacionária REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível próximas dos solutos a serem separados (polar, aromático. . . ) FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência

Cromatografia Gasosa Fase estacionária sólida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE sólida é a ADSORÇÃO A adsorção ocorre na interface entre o gás de arraste e a FE sólida • Sólidos com grandes áreas superficiais (partículas finas, poros) ADSORÇÃO • Solutos polares • Sólidos com grande número de sítios ativos (hidroxilas, pares de elétrons. . . )

Cromatografia Gasosa Fase estacionária líquida • O fenômeno físico-químico responsável pela interação analito + FE líquida é a ABSORÇÃO A absorção ocorre no interior do filme de FE líquida (fenômeno INTRAfacial) • Filmes espessos de FE líquida ABSORÇÃO • Grande superfície líquida exposta ao gás de arraste • Interação forte entre a FE líquida e o analito (grande solubilidade)

Cromatografia Gasosa Fase estacionária quirais • As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais não interagem diferencialmente com os isômeros óticos PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas). FÁRMACOS - Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica.

Cromatografia Gasosa Detectores Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste. Características ideais: ideais 1. Alta sensibilidade: 10 -8 a 10 -15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos 400 ºC. 5. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 6. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 7. Similaridade de resposta para todos os solutos. 8. Não destrutivo.

Cromatografia Gasosa Detectores REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.

Cromatografia Gasosa Detectores DCT UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. DCE SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. DNP ESPECÍFICOS: Detectam substâncias que possuam determinado elemento ou grupo funcional em suas estruturas

Cromatografia Gasosa Detectores - Funcionamento DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H 2 + ar. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação do DIC. Os eluatos queimados na chama H 2 + ar passam por uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de moléculas com N e P.

Cromatografia Gasosa Detectores – Limites de detecção DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD): Universal Observa-se para qualquer substância eluída. Sensibilidade: 0, 4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (104). DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID): Quase-universal Detecta qualquer substância que contenha ligações C-H. Não responde a gases nobres, H 2, O 2, N 2, CX 4, Si. X 4 (X=halogênio), CO 2, CS 2, H 2 O, NO 2, NH 3. Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (10 7 – 108). DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD): Seletivo Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0, 01 a 1 pg com linearidade até ng. (104) DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0, 1 a 1 pg (P) e 0, 4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)

Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Um dos detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa. É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de determinada razão m/z. Detecção TIC Universal Similar a DCT SIM Seletivo Maior Sensibilidade

Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico Em cada posição do cromatograma tem-se espectro de massa. CONTAGENS Cromatograma de íons totais: TIM ou TIC um CONTAGENS MASSA / CARGA TEMPO

Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico MASSA / CARGA CONTAGENS Em cada posição do cromatograma tem-se o sinal somente da m/z selecionada. Oferece a vantagem de registrar somente o sinal do constituinte de interesse, sendo “cego” para os demais CONTAGENS Cromatograma de íons selecionados: SIM TEMPO

Cromatografia Gasosa Detectores – Espectrometria de massas CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM EM CG Coluna Capilar Câmara de Ionização Vácuo Separador Molecular O gás de arraste leve (He) difunde mais rapidamente que o analito e tende a ser drenado para o vácuo. Interface Capilar Direta Com colunas capilares a vazão baixa de gás de arraste pode ser drenada pelo sistema de vácuo.

Cromatografia Gasosa Análise qualitativa O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, t. R’: t. R SINAL t. R ’ = t R - t. M t. R = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) t. M = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) t. M TEMPO t. R’ = Tempo de Retenção Ajustado (tempo médio que as moléculas do analito passam sorvidas na FE)

Cromatografia Gasosa Análise qualitativa Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0, 25 m Detector FID: 250 ºC Injetor com divisão de fluxo 1: 250 ºC Volume injetado: 1 L Mistura de benzeno, n-propanona, n-propanol, n-butanol, isobutanol e n-pentanol. Como se explica esta ordem de eluição? 1. A n-propanona elui primeiro devido à sua maior volatilidade. 2. O benzeno em segundo devido sua natureza apolar (menor e). 3. Para os demais compostos, cujas diferenças de polaridade não são elevadas, a volatilidade se torna o principal parâmetro que define a ordem de eluição.

Cromatografia Gasosa Análise quantitativa O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é: SINAL • Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois a banda necessita ser perfeitamente simétrica. • Área da banda cromatográfica. Área TEMPO Altura

Cromatografia Gasosa amostra Área Análise quantitativa Concentração tempo

Cromatografia Gasosa Análise quantitativa MASSA O fim da zona de linearidade pode ser detectado quando a razão (Área / Massa) diverge em mais de 5 % da inclinação da reta na região linear: 1, 05 S ÁREA / MASSA ÁREA A partir de certo ponto o sinal não aumenta mais linearmente 0, 95 S MASSA

Cromatografia Gasosa concentração na amostra Área Análise quantitativa Concentração Adicionada tempo

Cromatografia Líquida Cromatografia em fase líquida

Cromatografia Líquida - CLAE Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CLAE ? para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido ela deve dissolver-se nesse líquido. Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar de 32 até 4000000. DE FORMA GERAL: CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de volatilidade ou de estabilidade térmica.

Cromatografia Líquida Aumento de polaridade Insolúvel em água Solúvel em água Apolar Iônico Polar não iônico Tipos e Partição 102 Aplicações da Líquida Massa molecular Cromatografia Adsorção 103 Partição em fase reversa Partição em fase normal Troca iônica 104 105 106 Permeação em gel Exclusão Filtração em gel

Cromatografia Líquida Componentes típicos - CLAE

Cromatografia Líquida Esquema de um equipamento para CLAE

Cromatografia Líquida Requisitos dos sistemas de bombeamento 1 – Geração de pressões até 6. 000 psi 2 – Saída com ausência de pulsos 3 - Velocidades de fluxo de 0, 1 a 10 m. L/min 4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de 0, 5% ou melhor 5 – Componentes resistentes à corrosão Bomba recíproca (também são chamadas de bombas de pistão ou de diafragma)

Cromatografia Líquida Sistemas de injeção de amostras Suportam pressões de até 7. 000 psi Volumes típicos: 5 a 500 L Microamostragem: 0, 5 a 5 L

Cromatografia Líquida Fase móvel para CLAE Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a polaridade requerida na separação. • Eluição isocrática: • Quando a separação é feita utilizando um único solvente de composição constante. • Eluição com gradiente: gradiente • São utilizados dois ou três sistemas de solventes que diferem bastante entre si em polaridade. • Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é variada de modo programado, de forma contínua ou em passos. A eluição com gradiente produz efeitos similares aos produzidos pela programação de temperatura na CG.

Cromatografia Líquida Eluição com gradiente Coluna C 18, 5 m, fase reversa Detector fluorescência: excit. 334 nm – emis. 425 nm

Cromatografia Líquida Colunas para CLAE As colunas geralmente são construídas de aço inox, embora tubos de vidro com paredes resistentes sejam encontrados ocasionalmente. No entanto, estes últimos são restritos a pressões mais baixas do que 600 psi. Existem comercialmente centenas de colunas empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.

Cromatografia Líquida Colunas para CLAE • Remoção de material particulado Pré-coluna • Contaminantes do solvente • Contaminantes da amostra • Saturar a FM com a FE Aumenta a vida útil da coluna COLUNAS TÍPICAS • Material: Material aço inox • Comprimento: Comprimento 10 a 30 cm • Diâmetro: Diâmetro 4 a 10 mm • FE: FE Partículas de 5 a 10 m • Eficiência: Eficiência 40 mil a 60 mil pratos/metro

Cromatografia Líquida Separação isocrática de alta velocidade Coluna de alta velocidade e alta eficiência - 4 cm de comprimento - 0, 4 cm d. i. - FE: spherisorb 3 m 100. 000 pratos/metro FM: 4, 1% Et. Ac em n-Hexano 1– p-xileno 2 - anisol 3 - acetato de benzila 4 - dioctil-ftalato 5 - dipentil-ftalato 6 - dibutil-ftalato 7 - dipropil-ftalato 8 - dietil-ftalato

Cromatografia Líquida Fase estacionária para CLAE Basicamente são dois tipos de FE: • Pelicular: • Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso, esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 m, recoberto com uma camada fina e porosa de: • Sílica • Alumina • Resina de poliestireno-divinil-benzeno • Resina trocadora de íons • Partícula porosa: porosa • Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3 a 10 m. As partículas são constituídas dos mesmos materiais do recobrimento pelicular

Cromatografia Líquida Detectores As características desejáveis para os detectores para CLAE não são diferentes daquelas para CG. Existem dois tipos de detectores: • Propriedades universais (índice de refração, densidade ou constante dielétrica). • Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc). Características ideais: ideais 1. Alta sensibilidade: 10 -8 a 10 -15 g de soluto/s. 2. Boa estabilidade e reprodutibilidade. 3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de grandeza. 4. Tempo de resposta curto e independente da vazão. 5. Alta confiabilidade e facilidade de uso. 6. Similaridade de resposta para todos os solutos. 7. Não destrutivo. 8. Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.

Cromatografia Líquida Detectores • Absorbância • UV/Vis – S: 10 -9 g/m. L – FL: 105 • IV • Fluorescência – S: 10 -9 a 10 -12 g/m. L – FL: 103 • Índice de refração (universal) – S: 10 -7 g/m. L – FL: 104

Cromatografia Líquida Detectores • Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente. Embora não sejam tão explorados quanto os detectores ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade. • Amperométricos • Coulométricos • Condutométricos – S: 10 -8 g/m. L – FL: 104 • Polarográficos – S: 10 -12 g/m. L – FL: 106

Cromatografia Líquida Detectores • Espectrometria de massa - universal • Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa potencializa a técnica de separação e quantificação • Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM. Interface CL-EM

Cromatografia Líquida Detectores • Espectrometria de massa SIM CONTAGENS TIC CONTAGENS MASSA / CARGA TEMPO

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como um gás ideal e não contribui para o processo de separação, a FM líquida da CLAE interage tanto quanto a FE com os componentes da amostra. Isto torna o desenvolvimento dos métodos em CLAE um tanto mais complexo que na CG.

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE • PARTIÇÃO: PARTIÇÃO líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do suporte do empacotamento Adsorção e ligação química Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase reversa Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água) FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico) O componente menos polar é eluído primeiro por ser o mais solúvel na fase móvel. Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos) FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila) O componente mais polar aparece primeiro e o aumento da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE • É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses recobrimentos é uma cadeia C 8 (n-octil) ou C 18 (n-octadecil)

Cromatografia Líquida Campo Tipos de CLAE Misturas típicas Farmacêutico Antibióticos, sedativos, esteróides, analgésicos Bioquímico Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios Produtos alimentícios Adoçantes artificiais, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Produtos químicos Aromáticos condensados, surfactantes, propelentes, corantes industriais Poluentes Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas policloradas) Química forense Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue, narcóticos Clínica médica Ácidos de bílis, metabólitos de drogas, extratos de urina, estrógenos

Cromatografia Líquida Tipos de CLAE • ADSORÇÃO: ADSORÇÃO líquido-sólido. FE sílica ou alumina É a forma clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de HPLC. • TROCA IÔNICA: IÔNICA líquido-sólido. FE resina com capacidade de troca iônica • EXCLUSÃO: EXCLUSÃO líquido-gel. FE gel Um material polimérico, hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas, são capazes de promover a separação de acordo com os tamanhos das moléculas EXCLUSÃO DE TAMANHO Se o material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS

Cromatografia Para refletir e responder: Duas substâncias diferentes com a mesma concentração apresentarão a mesma área sob suas bandas cromatográficas? Para um mesmo analito, a área ou altura aumentam com o aumento da concentração. A área sob a banda cromatográfica de duas substâncias diferentes dependerá da resposta do detector para aquele tipo de substância, independentemente do tipo de detector utilizado.

Cromatografia Para refletir e responder: A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de analito? A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os casos em que isto ocorre?

FIM