UNIVERSIT DEGLI STUDI DI NAPOLI Prof S Andini

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI Prof. S. Andini

CROMATOGRAFIA La cromatografia è una tecnica impiegata per la Separazione dei componenti (analiti) di una miscela, e consente quindi di Identificare i diversi analiti della miscela. Miscela di componenti da separare B Miscela A+B Processo cromatografico e. A B A

Principi Teorici Perchè i componenti si separano La tecnica cromatografica utilizza due fasi immiscibili tra loro: una fase stazionaria o fissa (solida o liquida), e una fase mobile (liquida o gas) Qualsiasi tipo di cromatografia si basa sulla ripartizione dell’analita fra la fase fissa e la fase mobile La RIPARTIZIONE di mobile La RIPARTIZIONE

Metodi Cromatografici 3 -In colonna si vedono le bande colorate separarsi; si aggiunge alla colonna altro CS 2 clorofilla A e B Eluente CS 2

Richiami sulle Tecniche cromatografiche • Tra le tecniche più idonee all’analisi di campioni vi sono le cosiddette tecniche cromatografiche, utilizzate per separare e identificare singolarmente i componenti di una miscela Tipi di cromatografia ¡ ¡ ¡ In base alla forma del letto cromatografico l. Cromatografia su colonna (impaccata, opentubular) l. Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) In base allo stato fisico della fase mobile l. Cromatografia Liquida (LC) l. Gascromatografia (GC) l. Cromatografia fluida supercritica (SFC) In base al meccanismo di separazione l. Adsorbimento l. Ripartizione l. Scambio ionico l. Esclusione l. Affinità

Meccanismi principali di separazione Adsorbimento: La fase stazionaria è un solido. Ripartizione: La fase stazionaria è un liquido, che impregna un solido granulare inerte. Scambio ionico: La fase stazionaria è costituita da macromolecole con siti attivi ionizzati, i cui controioni possono essere scambiati con quelli eluiti nella fase mobile

Meccanismi principali di separazione Esclusione: La fase stazionaria è un solido poroso. In tali pori possono sostare le molecole degli analiti.

Quale tecnica usare? ¡ analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici Gascromatografia ¡ analiti non volatili o poco volatili, ionici, ionizzabili o non ionici, termicamente instabili Cromatografia liquida ¡ analiti non volatili o termicamente instabili ma non rivelabili dai comuni detector per LC Cromatografia fluida supercritica

Gascromatografia Nella gascromatografia il campione è vaporizzato e poi iniettato in colonna; un gas costituisce la fase mobile ma in questo caso non ha alcuna interazione con i soluti in quanto agisce soltanto da carrier, cioè trasporta i soluti lungo la colonna I composti iniettabili in un sistema GC devono avere Teb < 300°C e non devono essere termolabili, ovvero non devono degradarsi per effetto della temperatura, pena l’impossibilità di riconoscerli nel campione.

Metodi di classificazione Una prima classificazione si può fare in base allo stato fisico della fase stazionaria: cromatografia gas-solido (GS) cromatografia gas-liquido (GL) Gas-solido l fasi stazionarie di silice, allumina o carbone l meccanismo di adsorbimento l adatta per la separazione di gas come H 2, He, Ar, O 2, N 2, CO o idrocarburi a basso punto di ebollizione Gas-liquido • supporto inerte solido • liquido non volatile, legato covalentemente • meccanismo di ripartizione • moltissime applicazioni

Metodi di classificazione Una seconda classificazione prende in considerazione sia la geometria della colonna e la collocazione della fase stazionaria in essa: ¡ ¡ Colonne impaccate l contengono un supporto solido inerte, finemente suddiviso (comumente basato su terra di diatomee), ricoperto di fase stazionaria liquida Colonne capillari l WCOT (Wall Coated Open Tubular), strato sottile di fase liquida (1 µm) depositato sulla superficie l SCOT (Support Coated Open Tubular), strato poroso creato sulle pareti della colonna per trattamento o deposizione chimica l PLOT (Porous Layer Open Tubular), strato poroso polimerico o inorganico che funge da fase stazionaria per una cromatografia di adsorbimento

• Colonne capillari Forno di un gascromatografo in cui è visibile la colonna avvolta a spirale attorno al sostegno metallico

Confronto tra colonne impaccate e capillari Le colonne capillari possono essere lunghe fino a 100 m e hanno quindi un numero di piatti teorici enormemente più elevato rispetto alle colonne impaccate. Questa differenza è esemplificata nella figura a lato (in alto separazione con colonna capillare, in basso la stessa separazione con colonna impaccata)

Schema di un GC

Il carrier (elio, azoto, argon, idrogeno) deve avere un’elevata inerzia chimica nei confronti della fase stazionaria e del materiale di cui è costituita la colonna. Non deve essere segnalato dal rivelatore o deve fornire un rumore di fondo trascurabile

Cromatografia di ripartizione (o gas-liquido, GLC) Caratteristiche fondamentali della fase stazionaria: ¡ Bassa tensione di vapore (il punto di ebollizione della fase stazionaria liquida deve essere di almeno 100 °C superiore alla massima temperatura di operazione della colonna) ¡ Stabilità chimica ¡ Alta viscosità Fasi stazionarie più comuni: Polisilossani, polifenileteri, poliesteri, polietilenglicoli

Materiale di supporto per la fase stazionaria in GLC Caratteristiche fondamentali: • Distribuzione regolare delle dimensioni delle particelle • Buona conducibilità termica • Stabilità meccanica e termica • Elevato rapporto area superficiale/massa Il materiale di supporto in assoluto più usato è costituito da terre di diatomee calcinate (Chromosorb), costituite dai residui fossili di piante unicellulari.

Programmazione della temperatura di lavoro Confronto tra cromatografia a temperatura costante (isoterma, caso a) e a temperatura programmata (caso b) di idrocarburi lineari

Rivelatori per GC Uno dei punti di forza della tecnica GC è la grande varietà dei rivelatori disponibili. Alcuni sono aspecifici e quindi di uso generale (TCD, FID), altri sono invece molto specifici. Quelli universalmente accettati sono TCD ed FID, ma è sempre più diffuso l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa (MS): Rivelatori più utilizzati: ¡ ¡ a conducibilità termica (TCD) a ionizzazione di fiamma (FID) a cattura di elettroni (ECD) a ionizzazione in fiamma termoionico (rivelatore azoto-fosforo, NPD) Scelta del rivelatore La selezione è basata su: ¡ natura chimica degli analiti ¡ potenziali interferenze ¡ limite di rivelabilità richiesto ¡ disponibilità e/o costo

Rivelatore a termoconducibilità (HWD) ¡ ¡ si misura la variazione di conducibilità termica in un flusso di H 2 ed He (Conducibilità termica di elio ed idrogeno è circa 6– 10 > composti organici e non) si tratta di un rivelatore non specifico, quindi risponde ad ogni tipo di composto la sensibilità è una delle peggiori è un sistema non distruttivo Campione Riferimento

Rivelatore a ionizzazione di fiamma ¡ ¡ ¡ si misura la conducibilità elettrica di una fiamma in un campo elettrico è sensibile a tutti i composti contenenti legami C-C e C-H (per questo si tratta del rivelatore più utilizzato) In seguito alla combustione e quindi alla ionizzazione dell’analita, si crea una corrente elettrica fra i due elettrodi, proporzionale alla concentrazione non risponde a molecole volatili non infiammabili la sensibilità è buona è un sistema distruttivo E’sensibile soprattutto ai composti idrocarburici. Non è sensibile ai composti inorganici del carbonio (CO 2, CO, ecc. ), né ad altri composti inorganici (NH 3, SO 2, NOx).

Rivelatore a cattura di elettroni ¡ ¡ si misura la diminuzione di corrente dovuta alla cattura di elettroni da parte di analiti all’uscita della colonna è sensibile soprattutto a composti con gruppi funzionali elettrofili (alogeni, perossidi, nitrogruppi, ecc. ) Una sorgente di radiazioni β (emesse da tritio o 63 Ni) provoca la ionizzazione del gas di trasporto: Analiti(X) con elevata affinità elettronica possono catturare gli elettroni: La ricombinazione fra ioni N 2+e X- è 105 -108 volte più probabile di quella fra N 2+ ed elettroni. Si osserva una diminuzione di corrente al passaggio di analitielettron-affini ¡ ¡ la sensibilità è ottima per gli idrocarburi clorurati è un sistema non distruttivo

Rivelatore termoionico Rispetto al FID è provvisto di una perlina costituita da un sale di Rb o Cs, riscaldata a 600 -800 °C, dove avviene la liberazione di ioni Rb+/Cs+: Rb Rb+ + e. Gli atomi di rubidio interagiscono selettivamente con i radicali generati in fiamma da composti contenenti N e P (CN. e PO 2. ), la cui affinità elettronica è superiore al potenziale di ionizzazione del Rb. L’interazione fa aumentare il numero di ioni Rb+ rilasciati dalla perlina e quindi anche quello degli elettroni che possono raggiungere l’anodo, portando così ad un incremento dell’intensità di corrente. ¡ ¡ ¡ è specifico per composti contenenti azoto e fosforo (per questo è chiamato anche NPD) basato sulla formazione di radicali a partire da composti di Ne. P è un sistema distruttivo

La determinazione dei composti volatili è generalmente effettuata con la gascromatografia (GC). La GC è utilizzata per la separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi organici. Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo agroalimentare è quella accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) nella quale, è possibile avere informazioni strutturali sulle sostanze separate Interfaccia cromatografo – spettrometro di massa Spettrometro di massa al PC Iniettore Forno per la colonna Impostazione dei parametri strumentali

Esempio di cromatogramma GC-MS I database di cui dispongono i moderni strumenti GC-MS contengono gli spettri di massa di circa 400. 000 composti, tra cui quasi tutti quelli di interesse in chimica degli alimenti. Per confronto, è sempre possibile riconoscere i composti separati cromatogramma tempo di ritenzione spettri di massa m/z

Esempio di analisi GC-MS Quale che sia il tipo di pretrattamento, l’analisi GC-MS dei composti volatili permette di determinare un numero elevato di sostanze, quindi di avere un set di dati molto ampio. In un vino sono determinabili 50 -100 sostanze aventi caratteristiche di volatilità, in prevalenza alcoli, terpeni ed esteri. Con opportuni trattamenti, è possibile ampliare ulteriormente il gruppo di composti, a vantaggio della possibilità di caratterizzare le varietà Nella figura è riportato un esempio di analisi GC-MS di un estratto da vino Nebbiolo