CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN HPLC High

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC: High Performance Liquid Chromatography

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Definición: Técnica que realiza la separación de una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta eficiencia

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Definición: Técnica de separación que se lleva a cabo en una columna empacada con un soporte (gel de sílice o alúmina)

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Fase estacionaria: • Silica gel (polar) • Carbonato de calcio • Almidón • Alúmina (polar) Tamaño 40 - 63 μm. 63 – 200 μm. Diámetro: 5 - 50 mm Longitud: 5 cm – 1 m

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Fase móvil: Solventes utilizados en cromatografía en capa fina funcionan adecuadamente. Serie eluotrópica Pentano Éter de petróleo Hexano Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tolueno Xileno Benceno Cloroformo Acetona Acetato de etilo Acetonitrilo Iso-propanol Metanol Rubinson & Rubison Agua Química Analítica Contemporánea

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Mecanismo de separación: K = CS/CM

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Tipos de cromatografía en columna: Intercambio Iónico Exclusión Molecular Afinidad

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Cromatografía en columna Desventajas de la cromatografía en columna Diámetro: 5 - 50 mm Longitud: 5 cm – 1 m Tamaño de partícula: 40 – 200 μm Grandes volúmenes de fase móvil Tiempos de análisis largos Gran tamaño de muestra La identificación y cuantificación por algún método no acoplado

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Antecedentes históricos 1952 Premio Nobel de Química par Martin y Synge por el desarrollo de cromatografía líquido-líquido 1959 Primer trabajo de exclusión molecular aplicado a biopolímeros por Flodin y Porath 1960 Separación de solutos iónicos. Ionizables y neutros 1970 La técnica de HPLC se difunde ampliamente, la instrumentación se mejora 1970 -1980 Uso de modificadores de fase móvil para mejorar la eficiencia 1990 Se mejora la tecnología de fase reversa

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) 1951 Martin y Synge: Sugieren que altas presiones de fase móvil y tamaño reducido de partículas puede mejorar notablemente la eficiencia en la cromatografía en columna.

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Instrumentación: Reservorio de fase móvil

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Reservorios de fase móvil Fase Móvil: Libre de partículas Filtrar en membranas de 0. 45 12μm Libre de aire Tubo de Teflón 1/8’’ Recipiente de vidrio Filtro

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Sistema de bombea

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Sistema de bombeo de fase móvil Es el sistema mediante el cual la fase móvil se introduce através de la columna Características: Resistente a los solventes Amplio intervalo de flujos Facilidad de cambiar un solvente por otro De fácil manejo y mantenimiento

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Sistema de bombeo de fase móvil Sistema de bombeo a presión constante Bomba Neumática Sistema de bombeo a flujo constante Bomba tipo jeringa Bomba reciproca

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Bomba neumática 10 bar

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Bomba tipo jeringa Volumen de la cámara: 200 – 500 cm 3

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Bomba reciproca

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Bomba reciproca

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Puerto de inyección

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Puerto de inyección Válvula Rheodyne

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Características de la muestra Libre de partículas Filtrar en membranas de 0. 45 μm

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Puerto de inyección Diagrama de flujo válvula Rheodyne Loop de 10 -50 μl

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Puerto de inyección Diagrama de flujo válvula Rheodyne

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Columna

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Columna Acero ( Cr-Ni-Mo) Relativamente inerte a la corrosión química Longitud: 10, 12. 5 o 15 cm Diámetro: 4. 6, 6. 2 o 9 mm Soporte: 10, 5, 4 o 3 μm

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Soporte Silica microporosa Permeable a solventes (fase estacionaria) Diámetros : 3 - 10 μm Área superficial: 500 m 2/g Fases estacionaria enlazada covalentemente a la silica

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Instrumentación: Fase estacionaria Fase polar Fase no polar R= (CH 2)3 NH 2 Amino R= (CH 2)17 CH 3 Octadecilo R= (CH 2)3 C=N Ciano R= (CH 2)7 CH 3 Octilo R= (CH 2)2 OCH 2 CH(OH)CH 2 O H Diol R= (CH 2)3 C 6 H 5 Fenilo

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Modo de separación Fase Normal Fase Reversa Polaridad fase estacionaria Alta Baja Polaridad fase móvil Baja- media Media- alta Típica fase móvil Heptano/CHCl 3 CH 3 OH/H 2 O Orden de elusión 1º Menos polar 1º Mas polar

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Ventajas Fase normal • Picos menos coleados • Se estabiliza rápidamente a cambios de fase móvil • Reproducible Fase reversa • Separación de mezclas con polaridades diversas • Rápido equilibrio de la columna con la fase móvil • Fácil, rápido y reproducible

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Fase móvil

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Modalidades de separación + + - - Isocrático + - Curvas de gradiente Gradiente por etapas

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Modalidades de separación Isocrático Gradiente Elución de picos mas rápido, ahorro de tiempo de análisis, mayor productividad

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Efecto de la temperatura

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Efecto del tipo de fase estacionaria

Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC Efecto del flujo de fase móvil

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Efecto del p. H

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Efecto del fase móvil

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Detectores

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Tipo Respuesta Rango lineal Detecta Enlaces C-O, aromáticos, alquenos UV/Vis Arreglo de diodos Selectivo 10 -4 -10 -5 Florescencia Selectivo 10 -3 – 10 -4 Hidrocarburos policíclicos Conductividad Selectivo 10 -3 – 10 -4 NO 3 -, NO 2 -, SO 42 -, Cl 10 -3 – 10 -4 Ácidos orgánicos, azúcares Índice de refracción Universal -

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Celda

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC

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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC

CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN HPLC Aniones

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