Keuzedeel 0751 Verdieping Chromatografie Algemeen Marco Houtekamer 27

Keuzedeel 0751 Verdieping Chromatografie Algemeen Marco Houtekamer, 27 januari 2019

Voorwoord Deze presentatie gaat over het onderwerp chromatografie en is gemaakt voor studenten van de opleiding Laboratoriumtechniek van Scalda. Als student volg je de lessen die m. b. v. deze presentatie worden gegeven. Daarnaast zijn er aan het eind van een les vragen, die je maakt als huiswerk. Hoofdstuk één behandeld het ontstaan van chromatografie. In hoofdstuk twee worden zowel de open als gesloten systemen van chromatografie uitwerkt. Tot slot worden in hoofdstuk drie de scheidingsvariabelen uitgelegd en vervolgens praktisch behandeld aan de hand van rekenvoorbeelden. Je kan door de presentatie navigeren met de pijltjes toetsen op het toetsenbord, of door op de iconen te drukken onderaan de pagina. Als je op het “huisje” klikt, kom je bij de inhoudsopgave en van daaruit kan je ieder hoofdstuk aanklikken. Klik ook op de links die in de tekst staan voor meer uitleg! Veel plezier met het lezen van deze presentatie en het leren van het onderwerp chromatografie! 2

Inhoudsopgave H 1: Chromatografie - ontstaan H 2: Soorten chromatografie H 2. 1: Papierchromatografie H 2. 2: Dunne laag chromatografie H 2. 3: Kolomchromatografie H 2. 4: Gesloten systemen H 3: Scheidingsvariabelen H 4: Test je kennis! H 5: Samenvatting 3 pagina pagina pagina 5 6 7 9 17 29 32 52 53

Doelen 4 Hoofddoel: Het kunnen uitvoeren van een chromatografische analyse van een complex analysemonster, waarbij een juiste analyseopzet wordt gekozen. De totale tijdsduur is ongeveer 90 SBU (studie belasting uren) verspreid over 16 weken. Subdoelen: Na het doornemen van deze presentatie kan je tevens 1. Algemene begrippen van chromatografie noemen en uitleggen; 2. Instrumentatie, begrippen en voorbereidingsmethode van vloeistofchromatografie benoemen en uitleggen; 3. Instrumentatie, begrippen en voorbereidingsmethode van gaschromatografie benoemen en uitleggen; 4. Een juiste opzet maken inclusief instellingen voor een chromatografische analyse van een complex monster; 5. Chromatografische data interpreteren; 6. Berekeningen uitvoeren aan chromatografische analyses.

H 1: Chromatografie - ontstaan Chromatografie Bij chromatografie wordt een mengsel van stoffen gescheiden in zijn individuele componenten d. m. v. een verdeling over de stationaire en mobiele fase. Evenwicht voor component X: X mobiel X stationair En de evenwichtsconstante K: K = [X stationair]/[X mobiel] Oorsprong chromatografie 1906 - Michael Tsvet (Russische bioloog) bij het scheiden van plantpigmenten Term is Grieks: Chroma = kleur Grafein = schrijven 5 (Chemistry Libre. Texts, 2018)

H 2: Soorten chromatografie 6 Er zijn diverse soorten chromatografie: 1. Open systemen a. papierchromatografie b. dunne laag chromatografie c. kolomchromatografie 2. Gesloten systemen a. gaschromatografie b. vloeistofchromatografie Papierchromatografie: (chromatographer. com, 2018) Vloeistofchromatografie: (shimadzu. com, 2018)

H 2. 1: Papierchromatografie Principe scheiding: a. Oplosbaarheid in de mobiele fase (solvent of eluens) b. Adsorptie aan het papier Toepassing: scheiden van kleurstoffen Vragen: 1. Welke kleur lost het best op in de loopvloeistof (=eluens)? 2. Welke kleur adsorbeert het beste aan het papier? 3. Wat is hier de stationaire fase? Antwoorden: 1. Geel; 2. Rood; 3. Het papier 7 Papierchromatografie : (chromatographer. com, 2018)

H 2. 1: Papierchromatografie 8 Vertragingsfactor of Retardatiefactor (Rf): Rf = a/b A: loopafstand component (cm of mm) B: loopafstand eluens front (cm of mm) B Referenties voor Rf-waarden zijn gevaarlijk want deze zijn afhankelijk van de concentratie en samenstelling van het monster. Beter is: standaard en monster onder dezelfde condities analyseren. Referentie bladpigmenten: BINAS tabel 72 A Papierchromatografie : (chromatographer. com, 2018)

H 2. 2: Dunne laagchromatografie (TLC) Thin Layer Chromatography 9 De opzet: a. vergelijkbaar met papierchromatografie, alleen stationaire fase is een dunne laag (0, 1 -2 mm) kleine korrels (3 tot 20 µm) op glas- of kunststofplaat b. Stationaire fase: silica (90%!), cellulose of aluminiumoxide c. Mobiele fase: solvent waarin componenten oplossen (bijv. Ethanol) Voordelen t. o. v. papierchromatografie: 1. Kwantitatieve bepaling is mogelijk m. b. v. densitometer 2. Component kan van de plaat afgeschraapt worden voor spectrofotometrische bepaling of fractionering. Papierchromatografie : (chromatographer. com, 2018)

H 2. 2: Dunne laagchromatografie (TLC) Thin Layer Chromatography 10 Elutie principe: Het eluens (mobiele fase) lost componenten op en voert ze mee door de stationaire fase. Elutiesnelheid hangt af van: a. Oplosbaarheid van de component b. Affiniteit van de component met de stationaire fase c. Affiniteit van het elutiemiddel met de stationaire fase Elutie- of ontwikkelkamer Silicycle. com, 2019)

H 2. 2: Dunne laagchromatografie (TLC) Thin Layer Chromatography Stellingen: 1. Hoe sterker het eluens zelf geadsorbeerd wordt door de stationaire fase des te effectiever elueert het. 2. Hoe meer polair het eluens, des te sterker is de elutie. Welke stellingen zijn juist? 1. Juist, want het eluens verdringt dan de componenten van de stationaire fase. 2. Juist, zie afbeeling: Water en ethanol zijn veel sterker dan een apolair eluens als benzeen of cyclohexaan. 11

H 2. 2: Dunne laagchromatografie (TLC) Thin Layer Chromatography 12 Werkwijze: - In ontwikkelkamer: eluens eerst 10 minuten stabiliseren (evenwicht, verdamping) - Startlijn aangeven op de plaat met stat. fase - 5 µl monster opbrengen onderaan de plaat en in het eluens zetten in de kamer - Zowel monster als standaard tegelijkertijd analyseren (identieke omstandigheden) - Na elutie wordt de plaat gedroogd en volgt detectie door: a. Zichtbare gekleurde componenten (stippen) b. M. b. v. fluorescentie-indicatoren en bestraling met UV-lamp c. Door chemische reactie (plaat besproeien met reagens)

H 2. 2: Dunne laagchromatografie (TLC) Thin Layer Chromatography Beoordeling resultaat De Rf-waarde is afhankelijk van: - Type stationaire fase - Dikte van de stationaire fase - Polariteit van het eluens - Ionconcentraties en zuurgraad van het eluens - Scheiding van mobiele fase tijdens elutie - Hoeveelheid opgebracht materiaal - Dampsamenstelling in de ontwikkelkamer - Temperatuur 13

H 2. 2: Vragen Vraag 1: a) Bereken de Rf-waarde voor Stof Y b) Stof X heeft een Rf-waarde van 0, 60. Hoeveel cm ligt het punt X boven het opbrengpunt? Antwoorden: a) Rf (Y) = afstand Y/afstand eluensfront Rf(Y) = (9 -2) cm / (10 -2) cm = 7/8 = 0, 875 b) Rf (X) = 0, 60 = afstand X / afstand eluensfront 0, 60 = afstand X/(10 -2) => afstand X = 0, 60 * 8 = 4, 8 cm 14

H 2. 2: Vragen 15 Vraag 2: Juist of onjuist? a) De Rf-waarde is altijd kleiner dan 1; b) Als de Rf-waarde dichtbij 0 is, dan heeft een component veel vertraging (retentie); c) Als de Rf-waarde dichtbij 0 is, dan verblijft de component kort in de stationaire fase; d) De Rf-waarde is onafhankelijk van de temperatuur; e) De Rf-waarde van Chlorofyl-a met het eluens ethanol is bepaald op 0, 40. Als het eluens vervangen wordt door cyclohexaan wordt de Rf waarde hoger; f) De Rf-waarde van Chlorofyl-a met eluens ethanol en stationaire fase cellulose is bepaald op 0, 50. Als het eluens gelijk blijft en de stationaire fase vervangen wordt door silica dan wordt de Rf-waarde hoger.

H 2. 2: Vragen - Antwoorden 16 Antwoorden vraag 2: Juist of onjuist? De formule voor Rf is: Rf(X) = afstand X / elutiefront a) Juist, een component kan nooit een hogere afstand hebben dan het elutiefront b) Juist, als de Rf-waarde dichtbij 0 is, dan is de afgelegde afstand klein vanwege veel interactie met de stationaire fase en dus heeft een component veel vertraging (retentie); c) Onjuist, Als de Rf-waarde dichtbij 0 is, dan heeft een component veel vertraging en verblijft deze dus lang in de stationaire fase; d) Onjuist; de temperatuur heeft altijd invloed op een evenwicht; e) Onjuist, cyclohexaan is minder krachtig dan ethanol, dus afstand kleiner en Rf kleiner f) Onjuist, silica heeft meer adsorptiekracht dan cellulose dus de chl-a wordt meer vertraagd, afsand kleiner en dus Rf kleiner.

H 2. 3: Kolomchromatografie 17 Werkwijze: - Kolom (glazen buis) wordt gevuld met voorgeweekte stationaire fase. Let op: geen luchtbellen! Waarom niet? - Klein volume (1 ml) monster of standaard wordt opgebracht - Daarna eluens opbrengen - De componenten worden gescheiden en onderaan afzonderlijk opgevangen; - Deze eluaten worden soms opgevangen met een fractieverzamelaar Kolomchromatografie: (chromatographer. com, 2018)

H 2. 3: Scheidingsprincipe De afremming (retentie) van een component wordt veroorzaakt door verschillende molecuuleigenschappen, die gekoppeld zijn aan een scheidingsprincipe. Eigenschap Scheidingsoort Oplosbaarheid Verdeling Adsorptie Ionlading Ionenuitwisseling Molecuulgrootte Uitsluiting (op grootte) 18

H 2. 3: Scheiding – Verdeling vs adsorptie 19 Bij verdelingschromatografie verdelen de componenten zich over de stationaire en mobiele fase afhankelijk van de oplosbaarheid. De verschillende componenten doen dat op een verschillende manier. Dus: in de stationaire fase Toepassingen: > 80% van HPLC- en GC-analyses Bij adsorptiechromatografie kunnen de stoffen niet in de stationaire fase oplossen, ze blijven op het grensvlak hangen. Dus: aan de stationaire fase. Toepassingen: bij specifieke analyses van HPLC en GC vooral gebaseerd op polariteit. (Revise. im, 2018)

H 2. 3: Scheiding – Verdeling vs adsorptie 20 Daardoor is de isotherm van beide principes verschillend! Een isotherm geeft de verhouding weer tussen de concentratie van stof X in de stationaire fase t. o. v. de concentratie van stof X in de mobiele fase. De isotherm is afhankelijk van: - De eigenschappen van stof X - Temperatuur En alleen bij adsorptie ook: - Concentratie van stof X VERDELINGSCHROMATOGRAFIE ADSORPTIECHROMATOGRAFIE (Dictaat Scalda Chr 1)

H 2. 3: Scheiding – ionenwisseling 21 Bij ionenwisseling zijn het geladen deeltjes die door onderlinge aantrekking of afstoting de scheiding geven. De selectiviteit neemt toe volgens: M+ < M 2+ < M 3+ en X- < X 2 - < X 3 Toepassingen: > 90% bij IC-analyses (anionen en kationen), maar ook bij aminozuren (Bio-rad. com, 2019)

H 2. 3: Scheiding – molecuulgrootte 22 De scheiding is gebaseerd op molecuulgrootte: kleine moleculen worden vertraagd, grote moleculen niet. Kleine moleculen kunnen doordringen in de holtes van de stationaire fase en verblijven daardoor langer in deze fase. De retentie wordt dus groter naarmate de moleculen kleiner zijn. Vaktaal: gelpermeatie, gelfiltratie of molecuulzeef. (Eng: molecular exclusion) Toepassingen: bij monomeer/polymeer analyses. (isugelpermeationchromatography. com, 2019)

H 2. 3: Vragen 23 Vraag: Juist of onjuist? a) Als bij verdelingschromatografie de K factor hoog is, betekent dit dat een component goed oplost in de stationaire fase; b) Als de K factor hoog is, dan elueert een component sneller dan bij lage K-factor; c) Een kation wordt door een anionenwisselaar niet vertraagd, de K =0; d) Bij gelpermeatie zal een monomeer altijd eerder elueren als het polymeer.

H 2. 3: Vragen - Antwoorden vraag 2: Juist of onjuist? K = [X stationair]/[X mobiel] a) Juist, als K hoger is dan getal boven de streep hoger, is de [X stationair] b) Onjuist. Als de K-factor hoog is dan is een component langer in de stat. fase en is de retentie juist langer c) Juist, kationen zijn positief geladen en worden door de positief geladen anionwisselaar niet aangetrokken maar juist afgestoten; dus niet aan/in de stationaire fase; K = 0; geen vertraging d) Onjuist, het monomeer is kleiner dan een polymeer en zal dus meer in de stationaire fase doordringen, waardoor de retentie wordt vertraagd. 24

H 2. 3: Vragen 25 Vraagstelling 1 Welke kolom zal een betere scheiding geven: lang en dun of kort en breed met gelijke inhoud? 2 Waarom mag een kolom niet heel lang zijn? 3 Met welke chromatografische techniek kan elk van deze verbindingen het best gescheiden worden? a. Suikers b. Aminozuren c. Alkanolen d. Vetzuren e. Eiwitten f. Zouten (zeewater) g. Aromatische koolwaterstoffen h. Fenolen

H 2. 3: Vragen 26 Vraagstelling 4 Welke componenten worden op silica met een zwak polair eluens het sterkst afgeremd? a. Fenol of hydrochinon (1, 4 -dihydroxybenzeen) b. Butanol of butanon c. Octaan of octanon d. Nitrobenzeen of 1, 4 -dinitrobenzeen 5 Men gebruikt silicagel als adsorbens, hoe verandert de snelheid van elutie als men de polariteit van het elutiemiddel verhoogt? 6 De verdeling coëfficiënten van stoffen A, B en C zijn: KA = 0, 50; KB = 0, 20 en KC = 0, 75. In welke volgorde komen de stoffen uit de kolom? 7 We passen gelfiltratie toe op drie suikers: glucose (C 6 H 12 O 6); raffinose (C 18 H 32 O 16) en sucrose (C 11 H 22 O 11). In welke volgorde worden zij geëlueerd?

H 2. 3: Vragen 27 Vraagstelling 8 Een mengsel van Na. Cl, Cu. Cl 2 en Al. Cl 3 wordt over een kationenwisselaar (in zure vorm) geëlueerd. In welke volgorde komen de ionen uit de kolom? 9 Een mengsel van Na. Cl, Na 2 SO 4 en Na 3 PO 4 wordt over een anionenwisselaar (in basische vorm) geëlueerd. In welke volgorde komen de ionen uit de kolom? 10 Een mengsel van arginine, histidine en lysine wordt bij p. H = 7, 0 over een anionenwisselaar (in basische vorm) geleid. In welke volgorde komen de aminozuren uit de kolom? IEP Arg = 11, 2; IEP His = 7, 5 en IEP Lys = 9, 6 11 Een mengsel van alanine, asparagine, histidine en glutaminezuur wordt bij p. H = 8, 0 over een kationenwisselaar (in zure vorm) geleid. In welke volgorde komen de aminozuren uit de kolom? IEP Ala = 6, 0; IEP Asn = 5, 4; IEP His = 7, 5 en IEP Glu = 3, 2

H 2. 3: Antwoorden De antwoorden en uitwerkingen van de vragen worden gegeven door op onderstaand icoon te klikken. 28

H 2. 4: Gesloten systemen: 29 a. Vloeistofchromatografie (HPLC) b. Gaschromatografie (GC) Filmpje principe GC staat hier Waar zijn hier de stationaire en mobiele fases? Blokschema’s: HPLC GC Mobiele fase stationaire fase (Hitachi. com , 2019) stationaire fase (mlochemie. nl , 2019)

H 2. 4: Instrumentele technieken - evolutie 30 (Shimadzu. com , 2019) (LC/GC International , 2018)

H 3: Product LC of GC: Chromatogram t. R, A = bruto retentietijd van component A t’R, A = netto retentietijd van component A (de tijd die component A doorbrengt in of op de stationaire fase) t. M = retentietijd mobiele fase de tijd die elke component doorbrengt in de mobiele fase, ook genoemd: - “dode tijd” (t 0) en - tijd van de onvertraagde component 31

H 3: Scheidingsvariabelen zijn grootheden waarmee we het resultaat uitdrukken, maar ook de kwaliteit van de scheiding. De volgende variabelen worden behandeld: - Relatieve retentie Scheidingsfactor (of selectiviteitsfactor) Resolutiefactor Retentiefactor (of capaciteitsfactor) Schotelgetal Schotelhoogte (Van Deemter vergelijking) 32

H 3: Relatieve retentie (r): de verhouding tussen netto retentietijden. Meestal berekend ten opzichte van een (interne) standaard. Alle relatieve retentietijden van componenten in het chromatogram worden berekend t. o. v. de (interne) standaard. 33

H 3: Relatieve retentie - selectiviteitsfactor Een bijzondere vorm van relatieve retentie is de selectiviteitsfactor of scheidingsfactor (α). - Wordt berekend voor pieken die naast elkaar liggen. - Maat voor kwaliteit van de scheiding - α is altijd groter dan 1 34

H 3: Resolutiefactor De resolutiefactor (Rs) is een betere maat voor de scheiding dan de selectiviteitsfactor, want deze houdt ook rekening met de piekbreedtes. Voor basislijnscheiding geldt Rs > 1, 5 35

H 3: Vragen Bijgaand een chromatogram. De dode tijd is eerder bepaald op 66 seconden. a. Bepaal de netto retentietijden van piek 1, 2 en 3; b. Bepaal de relatieve retentie van piek 2 en 3 ten opzichte van 1; c. Bepaal de relatieve retentie van piek 1 en 2 ten opzichte van 3; d. Bepaal de selectiviteitsfactor voor piek 1 en 2; e. Bepaal de resolutiefactor voor piek 1 en 2. 36 2 3 1 W 1 = 0, 60 min W 2 = 0, 70 min

H 3: Antwoorden! De dode tijd is eerder bepaald op 66 s. a. t 0 = 66 s = 1, 1 min; t 1’= 3, 30 -1, 1= 2, 2 min; t 2’= 4, 45 -1, 1= 3, 35 min; t 3’= 7, 55 -1, 1= 6, 45 min. b. r 2, 1 = t 2’/t 1’ = 3, 35/2, 2 =1, 5; r 3, 1 = t 3’/t 1’ = 6, 45/2, 2 = 2, 9. c. r 1, 3 = t 1’/t 3’ = 2, 2/6, 45 = 0, 34; r 2, 3 = t 2’/t 3’ = 3, 35/6, 45 = 0, 52. d. α 1, 2 = r 2, 1 = t 2’/t 1’ = 3, 35/2, 2 =1, 5 e. Rs = 2*Δt/(w 1+w 2) = 2*(4, 45 - 3, 30)/ (0, 60+0, 70) = 1, 8 37 2 3 1 W 1 = 0, 60 min W 2 = 0, 70 min

H 3: Retentiefactor Definitie retentiefactor of capaciteitsfactor (k’): De mate van vertraging (retentie) die een component ondervindt op een bepaalde kolom wordt weergegeven door de verhouding tussen de tijd van de component in de stationaire fase gedeeld door de tijd in de mobiele fase. Eenvoudiger in formule: k’ = tr’/t 0 De k’ wordt vooral bepaald door het type en hoeveelheid van de stationaire fase. Ook is k’ afhankelijk van de temperatuur. 38

H 3: Vragen Vraagstelling 12 en 15 Bepaal uit de bijgaand chromatogram: a. De netto retentietijden van componenten A, B, C, D en E; b. De relatieve retenties van B, C, D en E ten opzichte van A; c. De selectiviteitsfactor voor A en B, C en D, D en E; d. De k’ voor de componenten A, B, C, D en E. 39

H 3: Vragen 40 Vraagstelling 16 Van een onvertraagde component wordt gemeten: t. M = 2, 5 min. Van een component wordt gemeten: t. R = 7, 5 min. a. Bereken de k’; b. Welk deel van de totale analysetijd brengt de component door in de mobiele fase? c. Het volume van de mobiele fase is twintig maal zo groot als die van de stationaire fase, bereken K. 17 a. Hoe groot is de retentiefactor voor een component die onvertraagd door de kolom gaat? b. Hoe groot is de retentiefactor als de hoeveelheid stof in de mobiele fase even groot is als die in de stationaire fase? c. Hoe lang duurt de meting als t. M = 20 sec en k’= 5, 0?

H 3: Antwoorden De antwoorden en uitwerkingen van de vragen worden gegeven door op onderstaand icoon te klikken. 41

H 3: Schotelgetal 42 Het schotelgetal (N) geeft aan hoe efficiënt de scheiding van een kolom is. N is afhankelijk van kolomlengte en de snelheid van het eluens (mobiele fase). Formules: t = brutoretentietijd W = piekbreedte basis t = brutoretentietijd W 1/2 = piekbreedte halve hoogte (C. U. Shah College of Phamacy, 2015)

H 3: Schotelgetal 43 Hoe vaker een component een evenwicht heeft tussen de concentratie in de stationaire fase en mobiele fase, des te beter de scheiding. Het begrip schotelgetal komt uit de destillatietechniek. Bij aardoliedestillatie zijn er echte schotels in een destillatiekolom. Op elke schotel is er evenwicht tussen vloeistof en damp. Hoe groter N des te efficiënter is de kolom voor die component! (mlochemie. nl , 2019)

H 3: Schotelhoogte 44 Schotelhoogte is een betere maatstaf voor het scheidend vermogen van een kolom dan schotelgetal. N kan heel groot zijn door L te vergroten, echter de analysetijd wordt dan onacceptabel. In het Engels: HETP – Height Equivalent of a Theoretical Plate Hoe efficiënter de kolom des te groter is N en des te kleiner is H. (Chromatographyshop. com, 2019)

H 3: Schotelhoogte-Van Deemter vergelijking De schotelhoogte wordt beïnvloed door: - De snelheid van de mobiele fase - De diffusiesnelheid in de mobiele en stationaire fase - De dikte van de stationaire fase De Van Deemter-vergelijking berekend de schotelhoogte (H) als functie van de snelheid van de mobiele fase (u). Met behulp van drie grootheden (A, B en C). Voor elk analysesysteem kan men de snelheid van de mobiele fase regelen, zodat de H zo klein mogelijk is. 45

H 3: Van Deemter vergelijking De grootheden in de Van Deemter vergelijking zijn: A- Eddydiffusie; hangt af van deeltjesgrootte. Mobiele fase legt directe en indirecte weg af. Eddydiffusie is onafhankelijk van u. De verschillen in weglengte veroorzaken piekverbreding. B – B-factor; longitudinale diffusie (willekeurige molecuulbewegingen) van een component. Als: u > verblijftijd < diffusie < piekverbreding < C – C-factor; onvolledig evenwicht. De instelling van het evenwicht van de component in de stationaire en mobiele fase kost tijd. Als de snelheid te hoog is dan kan de component niet in voldoende mate in de stationaire fase gaan. Als: u > evenwicht [X Dus optimalisatie! stationair]/[X mobiel] onvolledig piekverbreding >. 46

H 3: Van Deemter vergelijking Analysesysteem en de factoren die de schotelhoogte beïnvloeden: - type mobiele fase – draaggas bij GC - Deeltjesgrootte stationaire fase – bij HPLC 47

H 3: Resolutie II Resolutie is een maat voor de scheiding tussen 2 pieken. (zie pagina 35) Resolutie hangt ook samen met andere scheidingsvariabelen zoals selectiviteitsfactor (α), retentiefactor (k’) en het schotelgetal. Men verkrijgt de volgende formule: Deze relatie laat zien dat men de Rs op drie manieren kan vergroten: a. Door α > ; andere stationaire fase (kolom); b. Door N > ; kolomlengte >, echter invloed beperkt, want factor is √N !! c. Door k’> ; verlaging van temperatuur of veranderen stationaire fase (kolom) 48

H 3: Vragen Vraagstelling 19 Over de Van Deemter-vergelijking: a. Waar in de curve ligt de optimale snelheid van de mobiele fase? b. Stel: we verhogen de temperatuur, welke term(en) veranderen dan? c. Stel: we maken de kolom langer, welke term(en) veranderen dan? 20 Bepaal van bijgaand chromatogram: a. Hoe groot is de retentiefactor voor A en voor G? b. Hoe groot is de resolutiefactor voor A en B, B en C, F en G? c. Hoe groot is het aantal theoretische schotels voor C en voor E? Stel w. B op 0, 1 min. 49

H 3: Vragen Vraagstelling 21 Een kolom heeft een lengte van 50, 0 cm. Voor twee componenten blijkt de Rs = 1, 3. Hoe lang moet de kolom worden gemaakt om een goede scheiding (Rs = 1, 5) te maken? 22 Gegeven de volgende meetwaarden: Component Retentietijd (min) piekbreedte basis (min) A 5, 3 0, 22 B 8, 5 0, 27 C 11, 8 0, 28 D 15, 9 0, 44 Bereken: Stel hierbij de kolomlengte(L) op 10, 0 cm en de dode tijd (t. M) op 1, 5 min. a. De schotelhoogte voor elke component; b. De retentiefactor voor elke component; c. De selectiefactor voor elke component; d. De resolutiefactor voor A en B, B en C, C en D. 50

H 3: Antwoorden De antwoorden en uitwerkingen van de vragen worden gegeven door op onderstaand icoon te klikken. 51

H 4: Test je kennis! Maak de meerkeuzevragen en bekijk je score! Maak ook het kruiswoordraadsel. Antwoorden van de kruiswoordpuzzel staan hier. 52

H 5: Samenvatting Even alles op een rijtje: In H 1 werd het ontstaan van chromatografie beschreven. In H 2 komen de verschillende soorten chromatografie aan de orde, zoals: H 2. 1 Papierchromatografie H 2. 2 Thin Layer Chromatografie (TLC) H 2. 3 Kolomchromatografie H 2. 4 Gesloten systemen In H 3 worden diverse scheidingsvariabelen uitgelegd, zoals relatieve retentie, resolutie, schotelgetal en schotelhoogte via de Van Deemter vergelijking. Tot slot kan je in H 4 je kennis testen via meerkeuzevragen en een kruiswoordraadsel. 53

Literatuur Ardent Scientific. (2019, januari 27). Fundamentals of HPLC. Opgehaald van youtube: https: //www. youtube. com/watch? v=p 2 Kvz. K 81 s 2 g&feature=youtu. be Meer, A. v. (2013). Chemische analyse. Utrecht: Syntax Media. (2019, januari). mlo chemie. Opgehaald van chromatografie (H 18): https: //www. mlochemie. nl/index. php/18 -chromatografie Vooys, D. d. , Punt, R. , Lubbers, P. , & Vijver, R. v. (sd). Chromatografie I. Vlissingen, Nederland: Scalda. 54

Einde 55 Dank voor jullie aandacht!