Chromatografie Marco Houtekamer met de studenten Daphne Suurmond

Chromatografie Marco Houtekamer met de studenten: Daphne Suurmond Sanne d’Haens Björn Cousin Patricia de Putter (allen LTO 42)

2 Inleiding/doel de student kan aan het eind van deze les: - Principe van chromatografie uitleggen a. h. v. de twee fases Twee detectoren noemen van een GC Twee detectoren noemen van een HPLC Twee overeenkomsten noemen van GC en HPLC Twee verschillen aanduiden tussen GC en HPLC Een aantal berekeningen uitvoeren aan een chromatogram - Duur; 60 min Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

3 inhoud inleiding Chromatografie in het algemeen Principe van chromatografie Begrippen in chromatografie gaschromatografie Achtergrondinformatie Principe: Hoe werkt het? Apparaat: Hoe zit de GC in elkaar? Detectoren van de GC Vloeistofchromatografie (incl. ion-chromatografie) Achtergrondinformatie Principe: Hoe werkt het? Apparaat: Hoe zit de HPLC in elkaar? Detectoren van de HPLC de verschillen en overeenkomsten tussen de HPLC en de GC Optimalisatie chromatografie Berekeningen Conclusie vragen Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

4 Chromatografie in het algemeen Scheidingsmethode: een mengsel van stoffen scheiden naar de individuele componenten Toepassing: - kleurstoffen in voedingsmiddelen - producten van de olie-industrie Verschillende soorten chromatografie: Open systemen - dunne laag chromatografie - kolom chromatografie Gesloten systemen - gaschromatografie (GC) - vloeistofchromatografie (HPLC, UPLC of IC) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

5 Principe van chromatografie Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

6 Principe van chromatografie Chromatografie bestaat altijd twee fases: - de stationaire fase; meestal een kolom gevuld met actieve deeltjes die een interactie kunnen aangaan met componenten uit het mengsel - de mobiele fase; een gas of een vloeistof die het mengsel door de kolom heen duwt (met soms hoge druk; 200 bar!) De componenten uit het mengsel verdelen zich over beide fases. Afhankelijk van bijv. lading of zuurtegraad blijft een deeltje korter dan wel langer “plakken” aan de stationaire fase. Filmpje. Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

7 Principe van chromatografie Stationaire fase Mobiele fase Scheiden Dit is een voorbeeld van: Open systeem: kolomchromatografie Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

8 Principe van chromatografie Stationaire fase Mobiele fase Scheiden Dit is een voorbeeld van: Gesloten systeem: ionchromatografie Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

9 Basisbegrippen in chromatografie Retentietijd (t. R) Dode tijd (t 0) Netto retentietijd (t’R) t’R = t. R – t 0 Capaciteitsfactor (k) (=retentiefactor) k = t’R / t 0 Scheidingsfactor (α) (=selectiviteitsfactor) α = t’BR/ t’AR Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

10 Oefeningen Maak de oefeningen van mlochemie. Test Hoofdstuk 18 Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

11 gaschromatografie Achtergrondinformatie Hoe zit de GC in elkaar? Hoe werkt het? Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

12 GC: Achtergrondinformatie Wat is het? Scheiding van stoffen in dampfase; selectieve verdeling tussen stationaire en mobiele fase. Toepassingen? - Industrie: Bepaling van (on)zuiverheden in een monster Milieu: verontreinigingen in water, grond of lucht Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

13 GC: hoe werkt het? Film (Thermo) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

14 GC: hoe zit hij in elkaar Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

15 E en F: gasfles en gasregelaar (= gas is de mobiele fase!) De meest gebruikte draag gassen zijn: helium, stikstof en tegenwoordig ook waterstof. Gasregelaar regelt de druk van het draagas. (200 bar flesdruk -> 10 bar -> 5 bar werkdruk) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

16 A. Injecteren. Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

17 B: de kolom (=stationaire fase!) Kolommen zijn polair, apolair of mix van beiden Belangrijk voor scheiding (Rs !!) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

18 C: de detector Eigenschappen detector: - Grote gevoeligheid Stabiliteit Lineair Korte responstijd Hoge betrouwbaarheid Voorbeelden: FID (verbranding) of MS (massa) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

19 C: de detector- FID F. I. D. ; Flame Ionisation Detector Specifiek; organische verbindingen Massastroomgevoelig Principe: de werking berust op de verandering van de elektrische geleiding van de gasmassa in een waterstofvlam wanneer een organische molecuul in de vlam wordt geleid. Zeer lineair! Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

20 GC-FID: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

21 C: de detector- ECD ECD; Electron Capture Detector Specifiek; alleen gehalogeneerde verbindingen Massastroomgevoelig Principe: de werking berust op de eigenschap dat halogeenverbindingen vrije electronen kunnen opnemen. De e- worden geproduceerd door het draaggas te ioniseren met βstraling. (63 Ni) Nadeel: beperkte lineariteit en een radioactieve bron! Voordeel: zeer gevoelig (ppb/ppt) The Saga of the Electron-Capture Detector Feb 01, 2007 By Leslie S. Ettre, Peter J. T. Morris LCGC North America Volume 25, Issue 2, pg 164– 178 Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

22 GC-ECD: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

23 C: de detector- TCD TCD; Thermal Conductivity Detector Niet Specifiek (dus universeel): vrijwel alle verbindingen toepasbaar Concentratiegevoelig Principe: de werking berust op het verschil in warmtegeleiding van gassen. (Brug van Wheatstone) Voornamelijk toegepast bij analyse van H 2, O 2, N 2, CO, CH 4, C 2 H 6 enz. Nadeel: relatief ongevoelig (vanaf 0, 1 %) en beperkte lineair Voordeel: makkelijk toepasbaar Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

24 GC-TCD: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

25 D. dataverwerking Piek in een chromatogram Je hebt hier een piek, om de oppervlakte van deze piek te berekenen doe je: ½ * Lengte (in mm) * Breedte (in mm) Tegenwoordig wordt de dataverwerking gedaan met speciale software op de PC. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

26 Oefeningen Maak de meerkeuzevragen op mlochemie (H 19 Gaschromatografie) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

27 Vloeistofchromatografie Principe Hoe zit de HPLC in elkaar? Hoe werkt het? Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

28 HPLC: achtergrondinformatie Wat is het? Uitwisseling van moleculen tussen stationaire fase en de mobiele fase Toepassingen? - Milieu: verontreiniging in water, grond of lucht (bijv. PAK’s) Pesticiden/Herbiciden in voedsel Procescontrole: bijv. suikeranalyses Ecologie: voedingsgehaltes in water en grond Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

29 HPLC: hoe zit hij in elkaar? Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

30 HPLC: reservoir – mobiele fase! Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

31 HPLC: pomp Functie: de pomp duwt het eluens (de mobiele fase) door de kolom met een constante flow Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

32 HPLC: Injector Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

33 HPLC: kolom (=stationaire fase) - Principe: de moleculaire krachten van de verschillende moleculen in een monster worden langer of juist korter vastgehouden (=retentie!) door de stationaire fase. Types: Kationische kolom (Na+, K+, Ca 2+) Anionische kolom (F-, Cl-, Br-, SO 42 -) Normal phase (kolom is polair en eluens apolair) Reversed Phase (kolom is apolair bijv. C 18 en eluens is polair) Demo (Thermo) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

34 HPLC: de detector Eigenschappen detector: - Grote gevoeligheid Stabiliteit Lineair Korte responstijd Hoge betrouwbaarheid Voorbeelden: UV(spectro), Refractive index (RI) of conductiviteit (geleidbaarheid) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

35 HPLC: conductivity detector Geleidingsvermogen detector Principe: meet de verandering in geleiding van de mobiele fase door de aanwezigheid van verschillende ionen in het monster Niet specifiek Vrij ongevoelig (ppm) Micro-elektroden Filmpje Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

36 IC: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

37 HPLC: uv/vis detector Principe: componenten absorberen licht bij een specifieke golflengte. MEEST toegepaste detectie (75%!) Zeer lineair Vrij universeel, omdat veel componenten licht absorberen Redelijk gevoelig (LOD =1 ng) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

38 HPLC-UV: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

39 Oefeningen Maak de meerkeuzevragen op mlochemie (H 20 HPLC) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

40 De HPLC en de GC Verschillen/ Overeenkomsten Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

41 De verschillen en overeenkomsten tussen HPLC en GC Overeenkomsten Het zijn allebei chromatografen, dus basisprincipe is gelijk, evenwicht tussen - Stationaire fase - Mobiele fase Beiden kunnen mengsels scheiden in individuele componenten, daarna kan het gehalte van die componenten worden bepaald. Verschillen Mobiele fase: - HPLC; loopvloeistof - GC; draaggas Allebei de apparaten beschikken over een injector, kolom, detector en dataverwerking. Resultaten worden weergegeven in een chromatogram Injector en Injectievolume; - IC; kraan; 10 – 1000 µl - GC; poort; 0, 1 – 2 µl Kolom: - HPLC; ionen uitwisseling - GC; polair, apolair of mix Detectoren: - HPLC; geleidbaarheid, UV/VIS - GC; FID, ECD of TCD Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

42 Optimaliseren van de chromatografische methode Resolutie Temperatuur Lengte van de kolom Stationaire fase Mobiele fase Flow Hoeveelheid geïnjecteerde analyt (stof) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

43 resolutie Afhankelijk van drie factoren Retentiefactor (k) Scheidingsfactor (α) Schotelgetal (N) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

44 Voorbeelden van resolutie Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

45 Stationaire fase Retentiefactor Grote affiniteit → langere retentietijd en andersom Types: - polair (“water”) - apolair (“olie”) - ionpair (de + en – ionen vormen ionenpaar) - mixen van bovenstaand Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

46 Dimensies van de kolom (Lengte en diameter) Langer → meer inhoud → meer oppervlak van stationaire fase → meer looptijd → retentietijd wordt hoger Diameter deeltjes of kolom kleiner → oppervlak vergroot → meer interactie → piekvorm scherper. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

47 temperatuur Verhoging → moleculen trillen harder Affiniteit van component met de stationaire fase wordt minder Retentietijd korter Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

48 Mobiele fase Grote affiniteit → langere retentietijd en andersom. Let op: “apolair likes apolair” en “polair likes polair”. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

49 Flow Bepaal je met een flowmeter Hogere flow → kortere retentietijd. Stoffen in de mobiele fase verplaatsen zich sneller. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

50 Hoeveelheid geïnjecteerde analiet/stof beter resultaat →andere hoeveelheid stof injecteren. Meer analiet → verhoogde detecteerbaarheid Minder analiet → verhoogde resolutie Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

51 Berekeningen!!! 100 % methode Verbeterde 100% methode Externe standaard methode (ESTD) Interne standaard methode (ISTD) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

52 Berekeningen: 100 % methode 1 injectie van een monsteroplossing Analyse van een standaard is dus niet nodig Uitkomst is relatief (x % van het totaal) Eis: Alleen toepasbaar als het mengsel zuiver is. Dus: geen piek van oplosmiddel of deze niet integreren. En geen onbekende pieken in het chromatogram. Nadeel: houdt geen rekening met verschil in gevoeligheid (respons) van de componenten Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

53 Berekeningen: 100 % methode De data van de componenten: component RT (min) Piekopp (counts) % O 2 6. 02 998 16, 81 N 2 6. 64 1002 16, 87 CO 8. 70 1151 19, 38 CH 4 12. 18 1100 18, 52 CO 2 14. 01 1687 28, 41 Totaal - 5938 100 Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

54 Berekeningen: ESTD methode Minimaal 2 injecties nodig: van een monsteroplossing en een standaard! Vaak is 1 standaard voldoende i. v. m. goede lineariteit van de detector Eis: exact dezelfde hoeveelheid injecteren Eis: chromatografische omstandigheden gelijk Uitkomst is absoluut (bijv. ppm of ppb) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

55 Berekeningen: ESTD methode Responsfactor (f of Rf): een vermenigvuldigingsfactor die de relatie geeft tussen piekoppervlak en (massa)concentratie van een component m (massa) = Rf * A (oppervlak) => Rf = m/A ρ(massaconc) = Rf*A => Rf = ρ/A Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

56 Berekeningen: ESTD methode De data van een monster en een standaard: • • component Piekopp standaard (counts) Piekopp monster (counts) Conc. Standaard (ppm) Conc. Monster (ppm) A 250 199 105 83, 6 B 250 500 80 160 C 300 5 150 2, 50 D 350 110 200 62, 9 E 275 250 160 145 Bereken eerst de Rf van de component a. h. v. de standaard Rf = ρ/A Bereken daarna de concentratie in het monster ρ= Rf*A Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

57 Berekeningen: ESTD methode De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) Piekopp monster (counts) Conc. Standaard (ppm) Conc. Monster (ppm) A 250 199 105 83, 6 B 250 500 80 160 C 300 5 150 2, 50 D 350 110 200 62, 9 E 275 250 160 145 Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

58 Oefeningen: rekenen aan een chromatogram De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) Piekopp monster (counts) Conc. Standaard (ppm) Conc. Monster (%) Conc. Monster (ppm) A 600 444 200 ? ? B 1200 600 400 ? ? C 800 333 300 ? ? A) Bereken het relatieve gehalte (in %) in het monster via de 100% methode B) Bereken het gehalte (in ppm) in het monster via de ESTD methode Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

59 Oefeningen: rekenen aan een chromatogram De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) Piekopp monster (counts) Conc. Standaard (ppm) Conc. Monster (%) Conc. Monster (ppm) A 600 444 200 32, 24 148 B 1200 600 43, 57 200 C 800 333 300 24, 18 125 1377 100 A) Bereken het relatieve gehalte (in %) in het monster via de 100% methode B) Bereken het gehalte (in ppm) in het monster via de ESTD methode Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

60 Berekeningen: verbeterde 100 % methode Idem als 100% methode maar nu met Rf factor! 2 injecties: standaard -> voor bepaling Rf componenten - daarna monster -> bepaling gehalte Uitkomst is relatief (x % van het totaal) Eis: Alleen toepasbaar als het mengsel zuiver is. Dus: geen piek van oplosmiddel of deze niet integreren. En geen onbekende pieken in het chromatogram. - Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

61 Berekeningen: verbeterde 100 % methode De data van de componenten: Comp. RT Area Std (counts) Conc. Std (%) Rf (min) Area monster (counts) (%/counts) Monster Rf*Area (%) Gehalte Monster (%) O 2 6. 02 998 1100 20, 00 0, 0182 18, 16 15, 68 N 2 6. 64 1002 900 20, 00 0, 0222 22, 24 19, 20 CO 8. 70 1151 1000 20, 00 0, 0200 23, 02 19, 87 CH 4 12. 18 1100 900 20, 00 0, 0222 24, 42 21, 08 CO 2 14. 01 1687 1200 20, 00 0, 0166 28, 00 24, 17 Totaal - 5938 5100 100, 00 - 115, 84 100, 00 Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

62 Berekeningen: ISTD methode Toevoeging van extra component (= de interne standaard) aan monster/standaard Eisen ISTD: - moet goed gescheiden zijn (Rs>2) - mag niet in monster voorkomen - moet ongeveer dezelfde chemische eigenschappen als de te bepalen componenten - moet goed mengbaar zijn met standaard en monster Niet altijd eenvoudig om een goede ISTD te vinden! Voorbeeld: analyse % ethanol in monster; ISTD is ook een alkanol (kan zijn 2 -propanol) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

63 Berekeningen: ISTD methode Minimaal 2 injecties nodig: van een monsteroplossing en een standaard! Vaak is 1 standaard voldoende i. v. m. goede lineariteit van de detector Eis van ESTD vervalt! : niet noodzakelijk om exact dezelfde hoeveelheid injecteren Uitkomst is absoluut (bijv. ppm of ppb) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

64 conclusie Nu weet je meer over: Chromatografie (basisbegrippen) Gas Chromatografie (GC) Vloeistof Chromatografie (IC) de overeenkomsten/verschillen van GC en LC Berekeningen met chromatografische data Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

65 vragen Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter