HPLC CROMATOGRAFA La cromatografa es un mtodo muy

HPLC

CROMATOGRAFÍA La cromatografía es un método muy utilizado en todas las ramas de la ciencia y que permite la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún otro método de separación es tan potente y de aplicación tan general como la cromatografía.

HPLC �Usa una variedad de interacciones químicas entre el analito y la columna cromatográfica. �El analito se pasa a través de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase móvil liquida con alta presión (entre 1500 a 2200 psi). �El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras �La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.

HPLC Tiempo de Retención Retardo Único para cada analito. Depende: (naturaleza) Analito Fase estacionaria Composición de fase móvil

Fase Móvil Agua purificada Líquidos Orgánicos: • Metanol • Acetonitrilo Sales y buffers: • Contribuyen a la separación de componentes Gradiente de elución Variación de la composición de la fase móvil, para adaptarse a los diferentes analitos Separa la matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición de la fase móvil. Cada analito tiene un gradiente de elución óptimo para obtener la máxima separación de picos en el detector.

La información obtenida se analiza mediante una computadora acoplada al equipo; permitiendo: � Estandarizar la cromatografía � Identificar la naturaleza los picos eluídos � Cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los compuestos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

Tipos de HPLC v FASE NORMAL v FASE REVERSA v EXCLUSIÓN POR TAMAÑO v INTERCAMBIO IÓNICO

FASE NORMAL Y FASE REVERSA Cromatografía reparto Cromatografía líquido Fase estacionaria líquida se retiene sobre la superficie por adsorción. Cromatografía de fase unida químicamente Fase estacionaria líquida unida químicamente a la superficie.

FASE NORMAL (adsorción) Separa compuestos en base a su “Polaridad” Utiliza: Fase Estacionaria Polar Fase Móvil No Polar Compuesto a separar debe ser muy polar

Fundamento El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de retención. El uso de disolventes polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención, mientras que disolventes hidrófobos aumentan el tiempo de retención.

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor superficie. Poros Pequeños Poros Grandes Mayor superficie Mejor cinética para compuestos de tamaño más grande Una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.

Fase Estacionaria Sílice Hidrofílicas y porosas Alúmina

Fase Estacionaria q Sílice: q Alúmina: � Empleada como intercambiador � Es el más utilizado debido a que retiene a los solutos por adsorción. � Muy estable, lo que permite gran variedad de disolventes. � Capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del soluto. catiónico. � Su neutralización y acidificación hace posible su empleo como intercambiador aniónico. � Carácter anfotérico permite la determinación de solutos de carácter ácido y básico. � Deben evitarse los p. H extremos, que pueden llevar a la disolución de la fase estacionaria. Separación de sustancias orgánicas no saturadas Anillos bencénicos Isómeros de anillos aromáticos condensados

Disolventes Elevada polaridad: o Agua o Trietilenglicol

Fase Móvil � Se emplean solventes no polares, ya que puede existir desactivación de la columna de sílice o alúmina por adsorción de agua. � El agua es responsable de los mecanismos mixtos de retención y produce cambios profundos en la retención y selectividad. Ø Ø Ø Hexano Isopropilenglicol Tolueno Diclorometano Éter Acetato de Etilo

FASE NORMAL Ventajas Separación de solutos de polaridad mediana a alta Separación de isómeros posicionales con sustituyentes polares Desventajas o Falta de reproductibilidad de los tiempos de retención puesto que los disolventes próticos cambian el estado de hidratación de la sílice o alúmina de la cromatografía.

FASE REVERSA No polar Fase móvil Agua, metanol o acetonitrilo

FASE REVERSA Características �Los componentes más polares eluyen primero. �Si aumenta la polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución. �Los rellenos de fase unida química son de fase reversa cuando el recubrimiento enlazado es no polar. Polaridad del soluto: A>B>C

FASE REVERSA Características �Grupos R del siloxano es C 8 (n-octilo) o una cadena de C 18 (n-octadecilo). �Las cadenas se alinean en la superficie estructura semejante a brocha o cepillo.

FASE REVERSA Características �Cadenas más largas originan rellenos con mayor retención. �Una mayor longitud de cadena permite una mayor cantidad de muestra. �p. H no mayor de 7. 5 hidrólisis de siloxano.

FASE REVERSA

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Cromatografía por exclusión de tamaño Cromatografía de penetración sobre geles Cromatografía de filtración sobre geles Se pueden usar analitos de alto peso molecular. No implica interacción física o química entre los analitos y la fase estacionaria. A diferencia de otros tipos, hay un límite superior para el tiempo de retención, ya que ningún analito es retenido más tiempo que aquel para el cual la penetración en la fase estacionaria es total. Las moléculas son atrapadas eficazmente en los poros y eliminadas del flujo de la fase móvil.

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Las moléculas que tienen diámetros que son significativamente menores de poro del relleno pueden penetrar a través del laberinto de poros y así resultan atrapadas durante más tiempo, éstas son las últimas en eluir. Las moléculas que son más grandes que el tamaño medio de poros del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que eluyen.

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Diámetro entre 5 -10 μm Contienen una red de poros uniforme en los que pueden difundir las moléculas del soluto y del disolvente Polímeros Rellenos de columna Sílice

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO SÍLICE Ventajas: Gran rigidez, lo que facilita el relleno y permite el empleo de presiones más elevadas. Mayor estabilidad, lo que permite gran variedad de disolventes incluyendo el agua. Una equilibración más rápida al cambiar el disolvente. Buena estabilidad a elevadas temperaturas. Desventajas: Tendencia a retener solutos por adsorción. Capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del soluto.

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Los rellenos poliméricos se han comercializado con distintos tamaños de poro:

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO El volumen total de una columna rellena con gel de sílice o con un polímero poroso viene dado por: Vg : volumen ocupado por la matriz sólida del gel. Vi : volumen del disolvente retenido en sus poros. Vo : volumen libre exterior a las partículas de gel, volumen teórico del disolvente que es necesario para transportar a través de la columna a los componentes que son demasiado grandes para entrar en los poros de gel.

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Las moléculas de tamaño intermedio pueden transferirse a una fracción k del disolvente que ocupa los poros, el volumen de elución para esas moléculas retenidas es: Ve = V 0 + KVi Por lo tanto esta ecuación aplica a todos los solutos que pasan por la columna pero el valor de K difiere: Grandes, no pasan por los poros, K= 0 Los que pasan por los poros, K= 1

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO VR= Volumen de retención= tiempo de retención* caudal volumétrico. Límite de exclusión: Peso molecular por encima del cual no existe retención. Límite de penetración: Peso molecular por debajo del cual las moléculas de soluto penetran completamente por los poros.

EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Filtración sobre gel Utiliza disolventes acuosos y rellenos hidrofílicos Penetrabilidad sobre gel Utiliza disolventes orgánicos no polares y rellenos hidrofóbicos Exclusión por tamaño

APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA EXCLUSIÓN POR TAMAÑO Determinación de glucosa (G), fructosa (F) y sacarosa (S) en zumos enlatados.

APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍAEXCLUSIÓN POR TAMAÑO • Separación de ácidos grasos Columna de poliestireno, con un límite de tamaño de 1 x 10³. Fase móvil: tetrahidrofurano. Detector: índice de refracción.

Otras aplicaciones… Separación de moléculas de alto peso molecular, de bajo peso molecular y de sales. Determinación rápida de pesos moleculares. Distribución de pesos moleculares en grandes polímeros o productos naturales.

Ventajas y desventajas de la exclusión por tamaño: Ventajas • Tiempos de separación cortos y bien definidos. • Bandas estrechas que conducen a una buena sensibilidad. • No hay pérdida de muestra porque no hay interacción con la fase estacionaria. Desventajas • Número limitado de bandas en el cromatograma (escala de tiempo es corta). • No es aplicable a muestras de componentes de tamaño semejante, como mezclas de isómeros.

CROMATOGRAFÍA IÓNICA Se refiere a los métodos para separar y determinar iones en columnas con relativamente baja capacidad de intercambio iónico. Empezó a desarrollarse cuando se demostró que se podían separar fácilmente mezclas de cationes o aniones mediante las columnas de HPLC rellenas con resinas de intercambio catiónico o aniónico.

*Equilibrios de intercambio iónico Se basan en los equilibrios de intercambio entre los iones de una disolución y los iones del mismo signo que están en la superficie de un sólido de elevada masa molecular y esencialmente insoluble. Los sitios activos más comunes en las resinas de intercambio catiónico son los grupos de ácido sulfónico –SO 3 H+, un ácido fuerte, y los grupos de ácido carboxílico –COO-H+, un ácido débil.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO POR CATIONES Cuando un intercambiador iónico de ácido sulfónico se pone en contacto con un solvente acuoso que contiene un catión Mx+ , se establece un equilibrio de intercambio que puede expresarse mediante: x. RSO 3 -H+ + Mx+ (RSO 3 -)x Mx+ + x. H+

CROMATOGRAFíA DE INTERCAMBIO Iónico POR CATIONES x. RSO 3 -H+ + B+ (RSO 3 -)x B+ + H+ La elución con una solución diluída de ácido clorhídrico desplaza el equilibrio hacia la izquierda, lo que ocasiona que parte de los iones B + se transfieran a la fase móvil. Estos iones descienden luego por la columna en una serie de transferencias entre las fases estacionaria y móvil.

Rellenos de intercambio iónico � Se emplean pequeñas partículas esféricas porosas que se forman en la co-polimerización del estireno y del divinilbenceno emulsionados y para activar el polímero frente a los iones, se le unen grupos funcionales ácidos. � Otro tipo de relleno se prepara recubriendo micro partículas porosas de sílice, tal como las que se utilizan en la cromatografía de adsorción, con una delgada película del intercambiador.

Fase móvil: solubiliza a la muestra, conduce a tiempos de retención razonables e interactúa con los solutos de tal forma que favorece la selectividad. En cromatografía iónica las fases móviles suelen contener disolventes orgánicos miscibles con el agua y es a menudo contienen especies iónicas para formar un tampón. Los iones de la fase móvil compiten con los iones del analito por los puntos activos del relleno del intercambiador iónico.

Cromatografía iónica con inhibidores Los detectores de conductividad son una buen elección para la cromatografía iónica en la determinación de especies inorgánicas. Son sensibles y responden a los cambios de concentración. Limitación: la concentración del electrolito que se requiere para eluir los iones del analito, reducen la sensibilidad del detector.

Columnas inhibidoras � La columna inhibidora está rellena con una segunda resina de intercambio iónico que convierte con eficacia los iones del solvente en especies moleculares de ionización limitada, sin afectar la conductividad causada por los iones del analito. � H+ (ac) + Cl- + resina +OH- resina+Cl- (s) + H 2 O Cuando se determinan cationes se emplea HCl como eluyente y la columna inhibidora es una resina de intercambio aniónico en la forma de hidróxido.

Cromatografía iónica con una sola columna. � Se aumentan las diferencias de conductividad entre los iones de la muestra y los iones del eluyente con intercambiadores de baja capacidad que hacen posible la elución con soluciones que contienen bajas concentraciones del electrolito.