HPLC Detector Column oven thermostatic column Sample injection

HPLC Detector Column oven (thermostatic column Sample injection Drain chamber) unit Data processor (injector) Degasser Pump Eluent 1 (mobile phase) 11/24/2020 Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi

HPLC Nedir? é HPLC’nin Kısımları: 11/24/2020 é Hareketli Faz Rezervuarı Pompa Sistemi Numune enjeksiyon Sistemi Kolon Dedektör HPLC Çeşitleri é HPLC Uygulamaları é 2

11/24/2020 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi kısaca HPLC olarak adlandırılır. Yüksek performans; yüksek resolüsyonu (ayrımı) ifade eder. Mobil fazın yüksek basınçla ilerlemesi sağlandığı için de Yüksek basınçlı Sıvı Kromatografi olarak da adlandırılır. 3

• HPLC, bileşik karışımlarının tanınması, miktarının ölçülmesi ve bileşenlerin saflaştırılması için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. • HPLC’ de, bütün kromatografik yöntemlerde olduğu gibi, bir karışımın bileşenleri bir adsorban (sabit faz) ve bir çözücü (hareketli faz) arasında dağılır. • Sabit faz çelik bir kolon içinde çok küçük partiküllerin doldurulması ile hazırlanır. Küçük partikül ebadından (3 -5 um), dolayı mobil fazın sabit faz içinden geçebilmesi için basınç gereklidir. • Yüksek performans sıvı kromatografilerine, çok eski kromatografi türlerinin iyileştirilmiş ve hızlandırılmış şekilleri de denilebilir. • HPLC de kullanılabilecek birçok sabit faz vardır. Laboratuvarda normal faz (silika jel) ve ters faz (silika yüzeyine 18 C lu hidrokarbonun kovalent olarak bağlandığı faz) kolonları halen en çok kullanılan fazlardır.

11/24/2020 5

HPLC CİHAZI ŞEMATİK GÖRÜNÜŞÜ 11/24/2020 6

HPLC Cihazının Şematik Olarak Görünüşü 11/24/2020 Çözücü HPLC kolonu Enjektör Yüksek basınç pompası Detektör Atık 7

Başlangıçta basınç; modern sıvı kromatografisinin temel kriteri olarak düşünülmekteydi ve bu nedenle “Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi” olarak adlandırılmaktaydı. olarak sınıflandırılır. Bu nedenlerden dolayı Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi terimi kullanılmaktadır. 8 11/24/2020 Ancak bu günümüzde geçersiz kabul edilmektedir. Çünkü yüksek performans yalnız basıncın değil bir çok faktörün birleşmesiyle ortaya çıkmaktadır. Bu faktörler ; -çok küçük partiküllerin kullanılması, - gözenek boyutu ve dağılımı, - Yüksek basınçta kolon paketleme, - Doğru, düşük hacimli örnek enjektörleri, - Duyarlı dedöktörler, - İyi pompalama sistemi kullanımı,

HPLC’nın diğer klasik tekniklerle kıyaslandığında; Küçük boyutlu paslanmaz çelik kolonların kullanılması, Partikül boyutları çok küçük (3, 5 -10 m) matrikslerin kullanılması, Yüksek iç basınç ve kontrollü akış hızı sağlanabilmesi, Örnek gereksinimlerinin az olması, Sürekli akış dedektörleri ile küçük miktarların tayinine olanak sağlaması, Hızlı analiz imkanı ve yüksek ayırma gücüne sahip olması nedeniyle çok yönlü uygulamalara daha açık olduğu görülmektedir. 9 11/24/2020

HPLC’NIN KISIMLARI hareketli faz rezervuarı, pompa, enjektör, kolon, dedektör ve kaydedici (veya veri sistemi) içerirler. Ayırma kolonda gerçekleşir. Durgun faz m boyutlu poröz partiküllerden oluşur, bu nedenle hareketli fazın kolondan geçişi için yüksek basınç pompalarına ihtiyaç vardır. 11/24/2020 HPLC aletleri genelde; 10

11/24/2020 11

Kromatografik proses kolona örneğin enjeksiyonu ile başlar. 11/24/2020 Bileşenlerin ayrılması analit ve hareketli fazın kolona pompalanması ile devam eder. Ayrılarak elue olan her bir kompenentin pikleri kaydedilir. Her bir komponent için alınan dedektör cevabı bir kaydedici veya bilgisayar ekranında kromotogram olarak görüntülenir. 12

Modern bir HPLC cihazında bir veya daha çok cam veya paslanmaz çelik kaplar bulunur. Bunların her biri 500 m. L’den daha fazla çözücü alacak kapasiteye sahiptir. Sistemde kullanılan hareketli fazın seçimi uygulanan ayırma tipine bağlıdır. Bu nedenle sulu tamponlardan hidrokarbonlara kadar farklı polaritede çözücüler kullanılır. 11/24/2020 1 - HAREKETLİ FAZ KAPLARI VE ÇÖZÜCÜ MUAMELE SİSTEMLERİ HPLC sistemlerinde kullanılacak tüm çözgenler çok saf olmalıdır. İz miktardaki safsızlıklar kolonu etkileyerek 13 dedeksiyon sisteminde girişime neden olabilirler.

11/24/2020 Tüm solventlerin gazının alınması (degassing) zorunludur, aksi taktirde çözgende hava kabarcıklarının bulunması pompa ve kolonda problemlere neden olmaktadır. (Örneğin; kolonda kabarcık oluşturarak pik genişlemesine yol açar. ) Gazın alınması farklı şekillerde gerçekleştirilebilir; solventlerin ısıtılması, karıştırarak vakuma maruz bırakma, ultra sonifikasyon veya çözgen rezervuarına helyum gazı verilmesi. 14

11/24/2020 Sonuç olarak hareketli fazda bulunmasıgereken özellikler; saflık, dedektöre uyumluluk, örneğin çözünürlüğü, düşük viskozite, kimyasal inertlik ve uygun fiyat olarak sıralayabiliriz. 15

İzokratik elüsyonda bileşenler sabit bileşimli tek bir çözücü ile elüe edilirler. Tüm bileşenler kolonda aynı anda, farklı hızlarda göç ederler. 11/24/2020 Hareketli faz , örnek ve sabit faz arasındaki etkileşimlerin ayarlanabilmesi için değiştirilmektedir. Hareketli faz tipleri; izokratik, gradiyent ve politipik olmak üzere üç formda uygulanabilir. Gradiyenet elüsyon; polarlıkları birbirinden farklı iki (veya bazen daha fazla) çözücü sistemlerinin kullanıldığı tekniktir. Çözücü bileşimi sürekli veya basamaklı olarak değiştirilir. Politipik hareketli faz, karışık tip kromatografilerde tercih edilebilir. Aynı kolonu kullanarak birçok kromatografik teknik için uygulanabilir. 16

POMPA SİSTEMLERİ 11/24/2020 HPLC pompası, sıvı kromatografi sisteminin en önemli kısımlarından bir tanesidir. Sistemde; elüent’in; enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışını sağlayan kısımdır. HPLC analizlerinde kullanılan bir çok tip pompa mevcuttur. Bunlar; Emme Basma Piston Pompalar, Şırınga Tipi Pompalar ve Sabit Basınç Pompalarıdır. 17

NUMUNE ENJEKSİYON SİSTEMİ 11/24/2020 Örnekler; HPLC’ye enjeksiyon ünitesinden enjekte edilir. Enjeksiyon ünitesi basit olarak bir enjeksiyon valfi ve örnek haznesinden oluşur. Örnek Enjeksiyon öncesi hareketli fazda çözülerek bir şırınga ile valften enjekte edilir. 18

Numune Enjeksiyonu 11/24/2020 Numune enjeksiyonu yüksek basınç altıda yapılır. Enjekte edilen numune yüksek basınçta hareket eden hareketli faza karışır ve kolonun üstüne hareketli fazda çözünmüş olarak ulaşır. • • • Genellikle 5 -1000 L hacimdeki numune direkt olarak kolona enjekte edilir. Enjektör kolondan önceki son bileşendir. HPLC de kesinliği azaltan en önemli faktör enjeksiyon sırasında yapılan hatalardır. 6 -PORT Rotary Valve standart manuel enjektördür. Atomatik enjektörler daha uygundur. 19

KOLON 11/24/2020 HPLC’de kullanılan ayırma kolonları genellikle paslanmaz çelik olup yüksek basınçlara dayanıklıdır. Sıklıkla kullanılan kolonlar 4. 5 -5. 0 mm iç çaplı ve 1030 cm uzunluğundaki kolonlardır. Ancak araştırmanın ihtiyacına göre çok farklı boyutlarda kolonları ticari 20 firmalardan temin etmek mümkündür.

DURGUN FAZ; KOLON DOLGU MATERYALİ: 11/24/2020 HPLC durgun fazı kolon içindeki katı destek maddesidir. Durgun faz ve örneğin hareketli faz ile kimyasal etkileşimleri, göç derecesi ve örnek bileşenlerin ayrılmasını belirler. Uygulanacak kromatografi türünün prensibine göre kolon dolgu maddeleri farklıdır. (Kromatografi tipleri; sıvı-katı adsorpsiyon, normal faz, zıt- faz, iyon değişimi vb. ) 21

11/24/2020 Kolon dolgu materyalleri genellikle silika ve alümina esaslıdır; gözenekli (poröz), küresel spherical), düzensiz (irregular), pelliküler (pellicular) ve mikro tiplerinde olmaktadır. Dolgu maddesinin seçiminde tanecik biçimi, büyüklüğü, tanecik büyüklüğünün dağılımı, gözenek hacmi ve yüzey alanı gibi özellikler rol oynar. Yapılacak çalışmanın cinsine göre seçim yapılmalıdır. 22

DEDEKTÖR 11/24/2020 Dedektörler, kolondan elüe olan örnek bileşeninden alınan cevap doğrultusunda sinyallerin kromatogram üzerinde pik olarak ifade edilmesini sağlayan alettir. Dedektörler kolon sonrasına monte edilir. 23

11/24/2020 24

11/24/2020 25

11/24/2020 HPLC için ideal bir dedektör; geniş konsantrasyon aralığında; yüksek duyarlılığa, düşük gürültü seviyesine, bilinen seçiciliğe sahip olmalı ve kromatografik rezolüsyona kötü etki yapmaksızın kolon akıntısındaki bileşiklere duyarlı olmalıdır. Böyle bir dedektör sıcaklık ve basınçtaki değişmelere de duyarsız olmalıdır. Kullanılacak dedektör sistemi, analizi yapılacak numunenin cinsine uygun olmalıdır. Sıvı kromatografisinde en çok kullanılan dedektörler, ultraviyole veya görünür ışığın absorpsiyonuna dayanırlar. 26

HPLC ÇEŞİTLERİ 11/24/2020 Sıvı kolon kromatografisinin sınıflandırılması durgun faz ve ayırma prosesinin tabiatı üzerine yapılıyorsa bu durumda dört sınıftan bahsedilebilir. 1) İyon değişim kromatografisi 2) Moleküler elek kromatografisi (Jel Filtrasyon) 3) Affinite kromatografisi 4) Adsorbsiyon kromatografisi Normal Faz Kromatografisi Ters Faz Kromatografisi 27

Çözdüğü maddelerle kuvvetli bir etkileşmeye giren çözücülere kuvvetli çözücüler veya polar çözücüler denir. Çözücülerin polaritelerini göstermek için çeşitli indislere baş vurulur. Dağılma kromatografisinde en çok başvurulan polarite indisi P' dür. 11/24/2020 28

11/24/2020 29

HPLC, GC ve GC_MS UYGULAMA ALANLARI İLAÇ İlaç uygulamaları AR-GE ve kalite kontrol aşamalarında yapılan safsızlık analizleri, ağır metal, etken madde, organik solvent ve kalıntı solvent miktar tayini, temizlik validasyonu, çözünürlük çalışmaları, stabilite testleri, stereoizomer gibi testleri kapsamaktadır. 11/24/2020 GIDA Bebek mamalarında vitamin, gıda katkılarının ve pestisit kalıntılarının miktar tayini, gıda ambalajlarında renk ve daha birçok uygulama alanına sahiptir. ÇEVRE Hava Atık Su, Kaynak Suyu, Deniz Suyu ve Akarsular İçme Suyu, Havuz Suyu Cam, Çimento, Seramik, Diğer İnorganik Malzemeler PCB, Dioksinler, Asbest (Yasaklı Zehirli Maddeler) Testleri Yasal Testler (Ro. HS, ELV, REACH, vb. ) Yarı İletken, Elektronik Parça, Elektronik Kart Toprak, Gübre, Atık Malzeme Testleri PETRO KİMYA , KİMYA Biyolojik yakıtlar, boya, pigment, mürekkep, endüstriyel gaz, kağıt, petrol rafinerisi, kaplama, petrokimya, işlenmiş metal ürünleri ve tekstil konularını içeren birçok petrokimya ve kimya uygulamasında kullanılmaktadır. MAKİNE OTOMOTİV Otomobil boyalarının kalite kontrolü, motor yağı analizleri, biyodizel analizleri ve elektriksel bileşenlerin analizleri gibi birçok uygulama alanında makine ve otomotiv endüstrisinde kullanılıyor. 30

Miktar tayini; konsantrasyonu bilinmeyen bir örneğin solüsyonda tayin edilmesi; genelde örneğin standart çözeltisinin bilinen farklı miktarlarının kolona verilmesi ve elde edilen değerlerin korelasyonunun yapılması ile mümkün olabilmektedir. Genelde korelasyon pik alanları veya pik yüksekliklerinin kullanılması ile yapılır. 11/24/2020 31

11/24/2020 32

YÜKSEK PERFORMANSLI DAĞILIM KROMATOGRAFİSİNİN TİPİK UYGULAMALARI Uygulama Alanı Karışımlar İlaçlar Antibiyotikler, sedafitler, steroitler, analjezikler Biyokimyasallar Amino asitler, proteinler, k. hidratlar, lipitler Gıda maddeleri Suni tatlandırıcılar, antioksidanlar, alfatoksinler Endüstriyel kimyasallar Çok halkalı aromatikler, boyalar, yüzey aktif mad. Kirleticiler Pestisitler, herbisitler, fenoller, PCB’ler Uyuşturucular Uyuşturucu ilaçlar, zehirler, narkotikler Klinik Tıp Safra asitleri, ilaç metabolitleri, üre ekstrakları 11/24/2020 33

TEŞEKKÜRLER!!! 34 11/24/2020 MÜRÜVVET DÜZ