Transkripsiyon Transkripsiyon DNAy oluturan nkleotid dizisinin RNA polimeraz

Transkripsiyon

Transkripsiyon • DNA'yı oluşturan nükleotid dizisinin RNA polimeraz enzimi tarafından bir RNA dizisi olarak kopyalanması sürecidir. • DNA kalıbından RNA polimeraz sentezlenmesine transkripsiyon denir. enzimi ile RNA • Transkripsiyon h. içi genetik bilgi akışının ilk basamağıdır. • Çok h. li organizmalardaki h. lerin neredeyse tamamı aynı genomik DNA'ya sahiptir. • Örn: kas ve KC h. leri aynı genleri taşır. Bu h. lerin işlevleri genomlarındaki farklılıklara göre değil, gelişim ve farklılaşmayı yöneten düzenlenmş gen expresyonu paternleri ile belirlenir.

Prokaryotik ve Ökaryotik Canlılarda Transkripsiyon Her iki transkripsiyonda benzerlik olmasına rağmen bazı önemli farklılıklar bulunmaktadır. • Transkripsiyon ökaryotlarda prokaryotlara göre daha karmaşıktır. • Prokaryotlarda, ökaryotlarda olduğu gibi intron bölgesi yoktur. • Prokaryotlarda bir tek RNA polimeraz varken ökaryotlarda birkaç RNA polimeraz vardır. • Prokaryotik m. RNA polisistronik, ökaryotik m. RNA ise genellikle monosistroniktir. 3

RNA Polimerazlar • Transkripsiyondan sorumlu ana enzimdir. • 5'-3' denovo sentezi başlatabilir.

Prokaryot ve Ökaryotlarda Transkripsiyona başlama bölgeleri 5

Prokaryotlarda Transkripsiyon • Bir prokaryot olan E. coli ile yapılan çalışmalarda RNA polimeraz enziminin aktif formu olan holoenzimin 5 farklı alt üniteden oluştuğu saptanmıştır. Bunlar; • 2α, β, β', ω ve σ alt üniteleridir. • Bu alt birimlerden 2α, β, β‘ ve ω RNA polimeraz enziminin çekirdek yapısı olduğu ve transkripsiyon sırasında ribonükleotid polimerizasyonunu katalizlediği saptanmıştır. • Sigma faktörü “σ” ise RNA polimerazın, transkripsiyonu yapılacak olan genin promotor bölgesini tanımasını doğru bir şekilde bağlanmasını sağlayan alt ünitesidir. 6

Prokaryotlarda transkripsiyon 7

Bakterilerde transkripsiyonun Rho faktörüyle sonlandırılması 8

Prokaryotik Transkripsiyon • Negatif Kontrol • Regulatör tarafından engellenmediği sürece trk. Gerçekleşir. • -Laktoz var enzim lazım Reseptör Operatöre bağlanır trk VAR • Pozitif Kontrol • Regulatör uyarılırsa trk. Gerçekleşir • Laktoz yok enzim lazım değil trk. YOK

• P. larda kor polimeraz Trk. normal başlangıç noktasını işaret eden DNA dizisine spesifik olarak bağlanamaz. • Doğru bölge tanınmasında α sigma alt birim gereklidir. • RNA polimerazın bir genin trk. Başlatmak için bağlandığı DNA dizisine promotor denir. • Sigmanın yokluğunda RNA pol. Özgül olmayan bir şekilde ve düşük bir çekim kuvveti ile DNA'ya bağlanır. • Sigmanın rolü; -35 ve -10 dizilerinin ikisine de spesifik olarak bağlanarak polimerazı promotere yönlendirmek - trk. Başlangıcının genin başlangıcında olmasına öncülük etmektir.

Ökaryotik Polimerazlar • RNA pol I→r. RNA • RNA Pol II→m. RNA mi. RNA Inc. RNA • RNA Pol III→t. RNA r 5 S

Ökaryotik RNA Polimerazlar • Ökaryotik RNA polimerazlar, çekirdekte farklı gen gruplarının transkripsiyonunu yapan üç RNA polimeraz enzimi içerir. • RNA polimeraz I enzimi, 28 S, 18 S, 5. 8 S’lik ribozomal r. RNA alt ünitelerinin transkripsiyonunu yapar. • RNA polimeraz II enzimi, m. RNA, mi. RNA, Inc. RNA, küçük nüklear RNA’lar (sn. RNAs)ve küçük sitoplazmik RNA’ların (sc. RNA) transkripsiyonunu yapar. • RNA polimeraz III ise, t. RNA ve 5 S r. RNA ve bazı sn. RNA ve sc. RNA’ların transkripsiyonundan sorumludur. 14

Ökaryotik Transkripsiyon • Transkripsiyon Kompleksi • In vivo Trk. →Trk. mediatörleri+TF. leri • 5 TF. → TFIID(Bağlanmasıyla başlar)(TAF ve TBP bağlanır)→TATA (30) TFIIB (TBP’ye ve BRE’ye bağlanır) → RNA pol II komplekse katılır TFIIF TFIIE TFIIH • Pol II kompleksten ayrılır Trk. Başlar!!

Ö. da Transkripsiyonun Düzenlenmesi • Promotor→TATA, GC • Enhansırlar (Güçlendiriciler) • Trk. Aktivatörleri→Sp 1 Trk. Uyarır • Ökaryotik Represörler (Baskılayıcılar) (Promotor ve Enhansıra bağlanarak Trk. inhibe eder)

Ökaryotlarda RNA polimeraz II transkripsiyon kompleksinin oluşumu RNA polimeraz II enzimi promotere bağlanmadan önce promoter, TATA kutusuna bağlanma özgüllüğü taşıyan TATA binding protein (TBP) ve TBPassociated faktörlerden (TAF’lar) oluşan transkripsiyon faktörü TFIID tarafından tanınır. Sonra TFIIB (B) TBP’ye bağlanır ve Bunu TFIIF (F) ile birlikte RNA polimerazın bağlanması izler. En son TFIIE (E) ve TFIIH (H) komplekse eklenir 19

RNA sentezinin sonlanması • Ökaryotlarda RNA sentezinin sonlanması RNA polimeraz tiplerine göre değişmektedir. • RNA pol II’nin 3’ uçtaki bir poli A (AAUAAA) bölgesinden geçmesinden sonra gerçekleşir. • Bir başka sonlandırma modeli olan torpedo modeline göre de bir ekzonükleaz m. RNA’yı bu bölgeden keserek transkripsiyonu durdurur. • RNA polimerazın sentez sırasında ara sıra hataları düzelten özelliğininde olduğu belirlenmiştir. 21

Ökaryotlarda sentezlenen öncül m. RNA 22

Eukaryotlarda genetik biginin akışı 29

Kromatin ve Epigenetik • Kromatin yapı Ö. H. lerde gen ekspresyonunun kritik bir unsurudur. • Kromatinin temel yapısal birimi nükleozomdur. • Nükleozom yapısı!! • Kromatin yapısı; -Histon modifikasyonu -Nükleozomların yeniden düzenlenmesi Değişime uğrayabilir

• Histon asetilasyonu→Aktif kromatin • Kor histonların 2 bölgesi var;

• HAT: Histon Asetil transferaz→Koaktivatör • HDAC: Histondeasetilaz→Koreseptör • Trk. olarak aktif kromatin→H 3 lizin 4 met lizin 9, 14, 18, 23 asetilasyon • Trk. olarak inaktif kromatin→H 3 lizin 9 ve 27 metilasyon (Baskılanma ve kromatin yoğunlaşması ile ilişkili) • Promotor ve Güçlendiricilerin DNA’ları TF bağlanmaı için erişilir olsun diye nükleozom içermezler. • Bu nükleozomdan yoksun bölgeler DNAaz ile kesime karşı hassastır ve bu nedenle genom içinde DNAaz’a aşırı duyarlı bölgeler olarak tanımlanabilirler. • Kromatin yeniden yapılandırma faktörleri→Nükleozomların yerini değiştirir!!

Epigenetik

Epigenetik

Epigenetik Histonlar • DNA dizisindeki değişikliklerden kaynaklanmayan ama aynı zamanda kalıtsal olan gen ifadesi değişikliklerini inceleyen bilim dalıdır. • DNA replikasyonu sırasında atasal nükleozomlar oluşan iki yeni iplik arasında paylaştırılırlar. • Modifiye edilmiş histonlar yeni sentezlenen histonları da benzer şekilde modifikasyon geçirmeye yönlendirirler. . (devamlılık) • Polikomb Proteinleri!! PRC 1, PRC 2

DNA Metilasyonu • DNA’daki Sitozinin 5’C pozisyonuna bir metil grubu eklenir.

• Transpozonlarda yaygın→Genom içindeki hareketi baskılamak için • TET ailesi enzimleri→Metilasyon tersine çevrirebilir. • Metilasyon gametogenezde silinir embriyogenezde oluşur.

DNA Metilasyonu -Transkripsiyon sessizleştirilmesinde -Genomu transpozondan koruma -Genomik imprinting -X inaktivasyonu -Doku spesifik gen anlatımı

-mi. RNA -si. RNA

Kodlamayan RNA’lar • İnsan genomundaki fonksiyonel elemanlara dair bilgilerimiz 2012 yılında büyük çaplı bir proje olan ENCODE sayesinde önemli ölçüde artmıştır. • ENCODE projesinin amacı insan genomundaki farklı tipteki dizilerin fonksiyonunu tanımlamaktı. • İnsan genomunun %75’i transkribe olmakta.

• 200 nt. ↑……. Inc RNA (Xist, Tsix) • Küçük kodlamayan RNA’lar -mi. RNA (endojen kaynaklı)(m. RNA’nın yıkımı)(ds) -si. RNA (ekzojen kaynaklı)(translasyonu engeller)(ss) -pi. RNA -ti. RNA • Orta kodlamayan RNA’lar -sno. RNA’lar • sn. RNA, t. RNA, m. RNA !!!

RNA işlenmesi ve Dönüşümü • Bakteriyel m. RNA’lar trk. Sırasında eş zamanlı olarak Trl. için kalıp olarak kullanılırlar. • r. RNA ve t. RNA ilk transkriptleri işlenme basamağı geçirir. • m. RNA ilk transkriptleri işlenme basamağı geçirir. ( Stoplazmaya taşınmadan önce intronların çıkarılmasını içeren splaysing ).

Ökaryotlarda RNA Processing (RNA işlenmesi) • Öncül RNA’nın sentezlendikten sonra nükleustan sitoplazmaya geçmeden önce geçirdiği modifikasyonlar RNA işlenmesi olarak adlandırılır. RNA işlenmesi; 1. 5’ uca 7 -metilguanozin takılması (Şapkalama = Capping) 2. Adenin nükleotidlerinin 3’ uca bağlanması (Poliadenilasyon) 3. İntron kesip-çıkarma (splicing’den) oluşmaktadır. 53

5′ Capping (şapkalama) • Öncül m. RNA’nın sentezlendikten sonra 5′ ucuna metillenmiş guanin ilave edilmesi 5′ capping (şapkalama)olarak adlandırılır. • Capping, m. RNA’nın sitoplazmaya geçmesini ve ribozomlara bağlanmasını kolaylaştırır. • Ayrıca RNA transkriptinin endojen hücresel ekzonükleazların parçalamasından korur. 54

55

Poliadenilasyon • Sentez sonunda m. RNA’nın 3‘ ucuna poly A kuyruğu olarak tanımlanan yaklaşık 200 Adenin (A) nükleotidinin ilave edilmesi işlemidir. • Bu işlem için m. RNA’nın 3’ aşağı (downstream) kısmında spesifik son derece korunmuş 6 nükleotidlik (AAUAAA) dizisinden 10 ile 35 ribonükleotid ilerideki bir noktadan enzimatik bir kırılma meydana gelmektedir. Bundan sonra poliadenilasyon gerçekleşir. • Poly (A) kuyruğunun ilave edilmesi, m. RNA’nın sitoplazmaya geçişini ve translasyonunu kolaylaştırır. 56

Sentez sonrası m. RNA’nın poliadenilasyonu 57

m. RNA splicing • m. RNA splicing, transkripsiyondan (RNA sentezi) sonra kodlama yapmayan intronların öncül m. RNA’dan çıkarılması ve kodlama yapan ekzon parçalarının birleştirilmesi işlemidir. • Bu şekilde öncül RNA sitoplazmaya geçmeden önce olgunlaştırılarak translasyona hazır hale getirilir. • İntron ve ekzon sınırları arasında 5’ uçta donör GU dinükleotidi, 3’ uçta ise akseptör AG dinükleotidi bulunmaktadır. Ayrıca intron katlanma noktasında A nükleotidi bulunmaktadır. Bu dinükleotidler kısa splicing tanıma (konsensus) dizileridir. • Splicing işlemi için diğer diziler, sn. RNA (small nuclear RNA) molekülleri ve ilgili küçük nüklear ribonükleoproteinlerdir (sn. RNP). 58

Küçük nüklear RNA (sn. RNA) ve küçük ribonükleoproteinler (sn. RNP • Ökaryotik hücre nükleusunda bulunan 100 -200 nükleotid uzunluğundaki küçük RNA molekülleridir. • Bu moleküller, özel protein yapılar ile birleşerek küçük ribonükleoproteinleri (sn. RNP) oluşturur. • Üridin bakımından zengin oldukları için U 1, U 2, U 3, U 5 ve U 6 olarak isimlendirilen ve her geçen gün yeni tipleri tanımlanan sn. RNP molekülleri RNA kesilmesi (splicing) ile ilişkilidir. 59

Öncül m. RNA’dan intronların splicing (kesip-çıkarma) işlemi 60

Ribozomal RNA’nın transkripsiyonu: Transkripsiyon faktörleri UBF (upstream binding factor), SL 1 (selectivity factor 1) ve RNA polimeraz I birlikte ribozomal DNA’ya bağlanır ve transkripsiyon başlatılır. 61

Ökaryotik Ribozomal r. RNA İşlenmesi • Ribozomal r. RNA yaklaşık 13, 7 kb uzunluktaki ribozomal DNA (r. DNA)’nın RNA polimeraz I tarafından transkripsiyonu ile yapılır. • Öncül r. RNA, sno. RNA’lar aracılığı ile ilk önce 5‘ ucundan kesilerek 45 S’lik ribozomal RNA alt birimi elde edilir. Daha sonraki kesimlerle 18 S, 28 S ve 5. 8’lik r. RNA alt ünitelerini oluştururlar. 62

RNA polimeraz III’ün t. RNA ve 5 S r. RNA genlerini transkripsiyonu 63

64

t. RNA işlenmesi • t. RNA molekülü, RNA polimeraz III tarafından r. RNA molekülüne benzer şekilde daha uzun olan öncüllerden pret. RNA olarak sentezlenir. • RNaz P ve Rnaz D intronların çıkarılmasında görev alan enzimlerdir. Rnaz P, hem RNA hem de protein içerir. • Daha sonra CCA nükleotidleri, t. RNA’nın 3’ ucuna eklenir ve son olarak, t. RNA’nın karakteristik pozisyonlarındaki bazı bazlar modifiye edilir. Bu modifiye bazlar, dihidrouridin (DHU), metilguanozin (m. G), inozin (I), ribotimidin (T) ve psödouridin (ΨU)’dir. 65

Öncül t. RNA’nın işlenmesi 66

• r. RNA işlenmesi→ 18 S, 28 S, 5 S Tek ve uzun öncül transkriptin kesilmesiyle (Çekirdekçikte) Farklı bir genden transkribe olur (kromozom 1)

• t. RNA İşlenmesi→ 5’ ucu kesimi (RNAaz P ribozizmi) 3’ RNAaz sonra CCA eklenir (Bazlar modifiye edilir)

Ökaryotlarda m. RNA İşlenmesi

• Pol II’nin CTD bölgesi (C ucu bölgesi) (İşlenme enzimleri buraya bağlanır) • İlk basamak 5’uca “ 7 metil guanozin” cap eklenmesidir. (RNA’yı korumanın yanısıra Trl. Sırasında Ö m. RNA’ların ribozoma yerleşmelerini sağlar. • 3’ uca poliadenilasyonla (Poli A kuyruğu) (200 nt)(Poli A polimeraz) • (Hem Trl. Hem m. RNA kararlılığını düzenler!!

• Örn: Döllenmemiş yumurtada poli. A’sız m. RNA’dan bekler döllenince Poli A eklenir!!!

Kesip Eklenme Splaysing Mekanizmaları 1. 5’ kesip-ekleme noktasından kesim ve intronun içindeki bir A ile birleşimi kapsar. (A dallanma noktası) • İntron ilmek oluşturup kement benzeri ara ürün oluşur. 2. 3’ kesip ekleme noktasındaki kesim eşzamanlı olarak ekzonların birbirine bağlanmasıdır. • Böylece intron kement benzeri bir yapı olarak kesip çıkarılır ve daha sonra lineer hale getirilerek canlı h. lerin nukleusunda yıkıma uğrar.

1. Kesip ekleme işlemi splayozomlar (prot+RNA)+sn. RNP 2. Kendikendine kesip çıkarma (RNAaz. P ribozim) • Grup I intronlar→Lineer • Grup II intronlar→ Kement

• Hatalı kesip ekleme→ Kanser, Beta Talasemi • Alternatif Kesip ekleme; -Protein çeşitliliği -Drsophilada cinsiyet • Ekzonları farklı kombinasyonlarda birleştirme olasılığı aynı pre-m. RNA’dan çok sayıda m. RNA meydana getirir. (Gen expresyonunun doku spesifik ve gelişimsel düzenlenmesi için önemli)

RNA Editing • Bazı m. RNA’ların prot. Kodlayan dizilerini değiştiren RNA işlenme olayı • Baz modifikasyonları sonucunda gerçekleşen tek baz değişimlerini içerir. • Memelilerde Sitozin→Uridin Adenozin→Inozin

• Örnek: Kanda lipidleri taşıyan Apolipoprotein B -KC→ Apo. B 100 -Barsak B 48 -C→U • Örnek: Memeli Glutamat reseptörleri -A→I -Beyinde bu düzeltme olduğunda Glu. R Na+2 geçer Ca+2 geçemez bu düzeltme yokluğunda beyin gelişiminde ciddi hasar olur. -Depresyon, Epilepsi

RNA Yıkımı • Pre m. RNA’nın %90’dan fazlası nukleus içinde yıkılan intronlardır. • Yıkım işlemi dallanma noktasını tanıyan bir enzimle ya da; RNA molekülünün 5’ ve ya 3’ uçlarını tanıyan enzimlerin heriki yönde de RNA yıkımını katalizlemeleri ile gerçekleşir. • İşlenmiş m. RNA’ların 5’ ve 3’ uçları bu yıkım düzeneğinden sırasıyla cap eki ve poliadenilasyonla korunurlarken intronların korunmayan uçları tanınır ve yıkıma uğratılır. • H. ler intronlarının yıkımının yanısıra Trk. Esnasındaki yanlışlıklar sonucunda oluşan hatalı m. RNA’larını saptayan ve yıkıma uğratan kalite kontrol sistemlerine sahiptirler. • m. RNA’ların yıkımı genellikle Poli. A kuyruklarının kısaltılması (deadenilasyon) ile başlar. Bunu 5’ kepin çıkartılması ve 5’ yada 3’ uçtan nukleazlarla yıkım izler.

• Değişime uğrayabilir • mi. RNA • si. RNA Tek ve uzun öncül transkriptin kesilmesiyle Farklı bir genden transkribe olur (kromozom 1) (Çekirdekçikte)