Sklop C Vektorji Reporterski sistemi Transformiranje celic Priprava

Sklop C • Vektorji • Reporterski sistemi • Transformiranje celic ______ • Priprava c. DNA • Knjižnice Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Vektorji molekule, ki prenašajo tujo informacijo v gostiteljske celice Po izvoru delimo vektorje na: • plazmide in iz njih izvedene vektorje • bakteriofag in iz njega izvedene vektorje • nitaste fage in iz njih izvedene vektorje Po namenu uporabe so vektorji: • klonirni • ekspresijski (citoplazemski, periplazemski, sekrecijski) • transkripcijski, mutagenezni, za določanje zaporedja insertov… (CABRI: 35 kategorij vektorjev) CABRI: Common Access to Biological Resources and Information - konzorcij več evropskih zbirk mikroorganizmov, vektorjev in postopkov Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Klasifikacija vektorjev (Cabri) prirejeno po: Vicente et al. , World Journal of Microbiology and Biotechnology 1992; 8: 519 -526 1. Splošni klonirni vektorji (VECAP 402) Vektorji, ki so predvsem namenjeni za kloniranje fragmentov DNA. 2. Nadomestni vektorji (VECAP 403) Fagi s fragmenti DNA, ki omogočajo vnos tuje DNA na mesto neesencialnih delov vektorske DNA, ki jih obdajajo razmaknjene prepoznavne regije za določene restrikcijske encime. 3. Insercijski vektorji (VECAP 404) Genom insercijskih vektorjev je dovolj majhen, da omogoča kloniranje fragmentov DNA omejene dolžine (npr. 10 kb za fag ). Vektor ima posamezna mesta za rezanje z restriktazami v neesencialnih delih genoma. Vsi so fagi. 4. YAC (VECAP 405) Zaradi prisotnosti telomerov (TEL), centromera (CEN) in avtonomno podvajajočih se zaporedij (ARS) se vektor pomnožuje kot umetni kromosom kvasovk, ko pride do izcepa neesencialnega fragmenta DNA med elementoma TEL z restriktazami. 5. Vektorji kot promotorske sonde (VECAP 406) Uporabljamo jih lahko za kloniranje promotorjev in za zasledovanje aktivnosti promotorjev. Fragment DNA kloniramo v mesto, ki je pred reporterskim genom (in ima regijo za iniciacijo translacije ). 6. Sonde za iniciacijo translacije (VECAP 407) Uporabljamo jih lahko za kloniranje signalov za začetek translacije in za analizo njihove aktivnosti. Vektorji vsebujejo reporterski gen brez kodona za iniciacijo translacije , vendar imajo promotor. 7. Sonde za terminacijo transkripcije (VECAP 408) Uporabljamo jih za kloniranje zaporedij v klonirno mesto, ki je pred reporterskim genom. Fragmente DNA, ki vsebujejo terminatorska zaporedja, zasledujemo preko zmanjšanja izražanja reporterskega gena. 8. Sonde za eksportni signal (VECAP 409) Uporabljamo jih za kloniranje fragmentov DNA, ki vsebujejo zaporedja z eksportnim signalom, v klonirno mesto pred reporterskim genom. Detekcija poteka preko zasledovanja aktivnosti proteina , ki se je izvozil. 9. Vektorji za določanje nukleotidnega zaporedja (VECAP 410) Kloniranje fragmentov DNA za kasnejšo izolacijo ss. DNA in določanje nukleotidnega zaporedja. 10. Mapiranje epitopov (VECAP 411) Za označevanje vektorjev, ki bi jih uporabili za generiranje delov ali delecij gena za antigen, ki bi ga izrazili in tako pridobili fragmente za mapiranje epitopov. 11. Vektorji za pozitivno/negativno pregledovanje (VECAP 416) Vektorji za identifikacijo spremebe fenotipa. 12. Za konstruiranje vektorjev (VECAP 417) Plazmidi, ki vsebujejo kasete genov, polilinkerje ali ori-kasete, ki jih obdajajo prepoznavna mesta za restrikcijske encime, tako da jih zlahka izoliramo in uporabimo za pripravo vektorjev. 13. Priprava enoverižnih sond 14. Priprava genskih bank 15. Mestno-specifična mutageneza 16. Insercijska/delecijska mutageneza …. 35. Ekspresijski vektorji, namenjeni za čiščenje rekomb. proteina Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Vektorji /2 • Klonirni vektorji vnašajo tujo DNA v gostiteljsko celico in se v celici razmnožujejo ter s tem ustvarjajo kopije lastne in vključene DNA. • Klonirni vektor mora imeti: - zaporedje, ki omogoča razmnoževanje v gostiteljski celici - klonirno mesto za vnos želenega fragmenta - zapis za selekcijski marker • Ekspresijski vektor mora imeti še: - promotor - zaporedje Shine-Dalgarno - terminatorsko regijo - lahko ima še posebne lastnosti: operatorske regije, fuzijske partnerje, … (več v sklopu E: izražanje) Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Vektorji /3 Kategorije vektorjev: • plazmidi: sprejmejo 0, 1 kb -10 kb tuje DNA • bakteriofagi = fagi: do 8 kb - 20 kb tuje DNA • kozmidi, fagmidi, fozmidi: do 35 -50 kb tuje DNA • umetni kromosomi kvasovk (YAC): 100 kb - 1000 kb • bakterijski umetni kromosomi (BAC): 75 kb -300 kb • virusi / retrovirusi / bakulovirusi • transpozoni Za izbor vektorja je odločilna dolžina fragmenta, ki ga želimo klonirati. Nekateri tipi vektorjev samo posredujejo pri vključitvi tuje DNA v gostiteljski kromosom. visoko število kopij / nizko število kopij vektorja (meja ~20 kopij): število kopij v posamezni celici je odvisno od replikatorja Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Plazmidi krožna izvenkromosomska DNA, ki se v celici samostojno podvojuje • • • laboratorijski plazmidi so ds. DNA, večinoma z zapisom za odpornost proti antibiotiku (amp, tet, kan, cam. . . ), s klonirnim mestom (pogosto polilinker) in vsaj 1 mestom ori (replikatorska regija) običajno vsebujejo še dodatna zaporedja, pomembna za specifično uporabo vektorja plazmidna karta je grafična ponazoritev značilnih lastnosti plazmida pogosto uporabljani klonirni plazmidi so v celicah v velikem številu kopij (replikatorja p. MB ali Col. E 1: >15; mutacije v regiji ori do 3000) v celici je lahko hkrati več kot 1 tip plazmida, biti pa morajo kompatibilni (imeti morajo različno regulacijo podvojevanja) • klonirno mesto je lahko v povezavi z zapisom, ki omogoča fenotipsko ločevanje transformant (npr. -komplementacija) Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Plazmidi /2 nekateri tipi plazmidnih vektorjev: • • • za pripravo ss. DNA za vnos dolgih insertov ( iz plazmidov izvedeni vektorji) za izražanje zapisov v velikih množinah za povezavo z reporterskim sistemom vektorji za kvasovke vektorji za pripravo rekombinantnih proteinov v insektnih ali sesalskih celičnih kulturah • plazmidi za redkeje uporabljane bakterije Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

http: //wine 1. sb. fsu. edu/bch 5425/lect 25. htm Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

-komplementacija Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

-komplementacija /2 transformacija E. coli +IPTG, X-gal, o/n: Amp. R, bela Amp. R, modra Amp. S, ne raste Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

-komplementacija /3 Nature Reviews Genetics 4; 419 -431 (2003); doi: 10. 1038/nrg 1087 THE ART AND DESIGN OF GENETIC SCREENS: ESCHERICHIA COLI Figure 3 | -complementation. Active -galactosidase is a tetramer. The lac. Z M 15 deletion removes amino-acid residues 11– 41. This large internally deleted protein, often called the -fragment, can dimerize, but it cannot tetramerize. Amino-terminal fragments of -galactosidase as short as residues 3– 92, the -fragments, restore enzymatic activity to Lac. Z M 15 by allowing tetramers to form. Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

-komplementacija /4 IPTG = izopropiltio- -D-galaktozid www. mun. ca/biology/ scarr/Fg 15_08. ht X-gal = 5 -bromo-4 -kloro-3 -indolil- -D-galaktozid Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Plazmidi: kriteriji za izbor • • velikost vektorja število kopij / celico sestava polilinkerja možnost posredne detekcije prisotnosti inserta pri ekspresijskih vektorjih upoštevamo tudi: • končni ciljni organizem • konstitutivno/inducibilno izražanje • možnosti za regulacijo izražanja • močni/šibki promotorji • lokalizacija rekombinantnega proteina • fuzije za lažjo detekcijo in izolacijo • Plazmidi z >15 kb so zaradi velikosti manj primerni za transformiranje celic in jih težje izoliramo kot manjše (mali vektorji: 3 kb - 5 kb). • Izberemo taka klonirna mesta, da ne nastopajo v fragmentu, ki ga želimo vstaviti, uporabna interna mesta (v fragmentu) pa se ne pojavljajo v vektorju. • Upoštevamo posebne zahteve pri kasnejšem delu (npr. priprava ss. DNA, testiranje translacije, preverjanje nukleotidnega zaporedja, …) Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Plazmidi s posebnimi lastnostmi /1 Plazmidi za izražanje v sesalskih celicah: • dosežemo lahko prehodno izražanje ali pa ustvarimo stabilne celične linije • za prehodno izražanje transficiramo s plazmidom, ki nima posebnih selekcijskih markerjev in se ne podvaja; celice analiziramo po 1 -4 dneh • za pripravo stabilnih transgenskih linij rabimo vektorje s selekcijskimi markerji • po transfekciji celic selekcioniramo seve, ki izražajo vneseni selekcijski marker (odpornost proti neomicinu ali nekaterim drugim antibiotikom) • nekateri sistemi vključujejo plazmidne vektorje v kombinaciji z virusi / retrovirusi Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Plazmidi s posebnimi lastnostmi /2 Plazmidi za delo z nestandardnimi bakterijami: • • mnogi plazmidi za E. coli so neprimerni, ker imajo nekompatibilne replikatorje primerni so replikatorji s širokim spektrom gostiteljev (RK 2, RSF 1010). antibiotiki za selekcijo morajo biti preverjeno učinkoviti nekaterih vrst ne moremo transformirati s kemijsko modifikacijo ali elektroporiranjem, zato tujo DNA vnašamo s konjugacijo - rabimo dodatne proteine, ki so običajno na pomožnem plazmidu. Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

http: //www. biochem. wisc. edu/inman/empics/0022 a. jpg Bakteriofag Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Bakteriofag /2 Pri bakteriofagu poznamo litični in lizogeni način razmnoževanja: Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Fag in izvedeni vektorji • wt (48 kb): • geni za lizogeno rast in imunska regija (skupaj ~30 % celotne DNA) niso potrebni za litični cikel in jih lahko nadomestimo z drugo DNA vektorje, izvedene iz , lahko pakiramo v fagne glave in vitro (~10 % učinkovitost) za pakiranje mora biti skupna dolžina konstrukta 78 % - 105 % dolžine wt DNA izvedeni vektorji imajo vnesena klonirna mesta na delih, kjer se sicer začnejo nadomestljive regije izrežemo, izoliramo levo in desno ročico, nato ligiramo insert vektorje na osnovi bakteriofaga uporabljamo za pripravo genomskih knjižnic • • • Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

http: //escience. ws/b 572/L 16 a. htm Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Nitasti fagi in izvedeni vektorji http: //wine 1. sb. fsu. edu/bch 5425/lect 33. htm • wt M 13: • • M 13, f 1, fd ~ 6, 4 kb; inficirajo samo seve F+, F’ ali Hfr obstajajo v obliki ds. DNA (v celici 20 -40 kopij) in ss. DNA (sprošča se brez liziranja celic: 100 -200/h) transformacija bakterij in izolacija ds. DNA sta kot pri plazmidih iz M 13 izvedeni vektorji imajo gen za odpornost proti antibiotiku ter fagni in plazmidni ori; ss. DNA dobimo šele po infekciji s pomožnim wt fagom • vektorje na osnovi nitastih fagov uporabljamo za pripravo ss. DNA in za predstavitev rekombinantnih proteinov na površini fagov Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Iz plazmidov izvedeni vektorji FAGMIDI: • plazmidi z dodatnim mestom ori, ki izhaja iz nitastih fagov (f 1) • celice gojimo enako kot tiste, ki so transformirane s plazmidom • fagmidno ds. DNA izoliramo kot običajne plazmide • po infekciji celic, ki vsebujejo fagmid, z divjim pomožnim fagom (wt helper phage) se aktivira fagni ori, kar povzroči sintezo ss. DNA, ki se nato izloča iz celic v medij • fagmidi obstajajo v (+) in (-) verziji z različno orientiranima mestoma ori, kar omogoča sintezo ss. DNA z ene ali druge verige • ss. DNA občasno rabimo za določanje nukleotidnega zaporedja in za mutagenezo. Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Iz plazmidov izvedeni vektorji /2 KOZMIDI: • plazmidi, ki vsebujejo mesto cos iz bakteriofaga • v celici so v velikem številu kopij (replikator Col. E 1) • lahko jih pakiramo v glave bakteriofagov (pod pogojem, da je med mestoma cos 40 kb - 50 kb velik insert) • uporabljamo jih za pripravo genomskih knjižnic • v E. coli včasih izgubljajo dele insertov FOZMIDI: • kozmidi, ki imajo namesto ori Col. E 1 mesto ori iz bakteriofaga • v bakterijski celici so v 1 -2 kopijah • ne izgubljajo delov inserta Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Kloniranje s posredovanjem kozmidov Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Pakiranje bakteriofagne DNA Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Iz plazmidov izvedeni vektorji /3 BAC (umetni bakterijski kromosomi): • plazmidi z dodanim replikatorjem F-faktorja in prilagojeni za vgradnjo zelo dolgih fragmentov DNA (100 kb - 500 kb); 1 -2 kopiji/celico http: //homepages. strath. ac. uk/~dfs 99109/BB 211/YACs. html YAC (umetni kromosomi kvasovk): • kot BAC, a za delo v kvasovkah; do 1 Mb • manj stabilni konstrukti kot BAC, zato jih opuščajo Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Iz plazmidov izvedeni vektorji /4 Plazmidi za delo s kvasovkami: • kot replikator uprabljamo predvsem ARS (avtonomno podvajajoča se zaporedja), ki izhajajo iz genoma kvasovke in replikator iz naravnega kvasovkinega plazmida 2 m. • v celicah je 10 -30 kopij • pogosto uporabljamo vektorje, ki jih lahko kloniramo tudi v E. coli (prenosljivi /shuttle/ vektorji) in imajo torej 2 replikatorja • integracijski vektorji nimajo kvasovkinega replikatorja; služijo le za vnos želenega zapisa + selekcijskega markerja v genom kvasovke • selekcijski marekerji komplementirajo okvarjeno biosintezno pot (npr URA 3 v sevih, ki so ura 3 -) Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Reporterski sistemi • Transkripcijske fuzije: SD-zaporedje je na reporterskem delu • Translacijske fuzije: na 5’-koncu so regulatorna zaporedja (5’-UTR) in ATG (lahko pa celotno kodirajoče zaporedje), ki pripadajo zapisu, ki ga preučujemo, sledi pa zapis za reporter v istem bralnem okviru • • GFP (zeleni fluorescirajoči protein) luciferaza CAT (kloramfenikol-acetiltransferaza) -galaktozidaza Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Two types of Lac. Z fusion. The target gene yfg ('your favourite gene') is transcribed from its promoter (P). a | a 5' fragment of the target gene (yfg') is fused to a wild-type lac. Z+ gene to make a transcriptional fusion. In this construct, the transcription of lac. Z+ is driven by the yfg promoter. The polycistronic m. RNA that is produced is translated by ribosomes that bind independently to the ribosome-binding sites (rbs) that are located immediately upstream of each open reading frame to produce an amino-terminal fragment of Yfg and wild-type -galactosidase. b | a 5' fragment of the target gene (yfg') is fused in the correct translational reading frame to a large 3' fragment of lac. Z ('lac. Z) to produce a translational fusion. Transcription of this hybrid gene is driven by the yfg promoter (P), and the m. RNA that is produced is translated from the yfg rbs to produce a hybrid protein with amino-terminal sequences of Yfg and a large functional carboxy-terminal fragment of galactosidase. Nature Reviews Genetics 4; 419 -431 (2003); doi: 10. 1038/nrg 1087 THE ART AND DESIGN OF GENETIC SCREENS: ESCHERICHIA COLI Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Reporterski sistemi /2 • GFP iz meduze Aequorea victoria, fluorescira v spodnjem zelenem delu vidnega spektra. Detektiramo oddano svetlobo. Omogoča zasledovanje izražanja poljubnega označenega zapisa in vivo. Obstajajo mutanti, ki močneje fluorescirajo in/ali fluorescirajo v drugih delih spektra (BFP, YFP, RFP). Uporabljajo ga za lokalizacijo označenih proteinov v celicah, lahko tudi spremljajo gibanje označenih proteinov v realnem času. • luciferaza iz kresnic, bakterij ali drugih organizmov: v prisotnosti kisika in ATP povzroči razgradnjo luciferina (različne strukture, odvisno od organizma) v oksiluciferin, pri čemer nastane svetloba. • CAT je bakterijski encim, ki inaktivira kloramfenikol, tako da ga acetilira. Raven izražanja določamo s testom aktivnosti, v katerem detektiramo fluorescenčno ali radioaktivno označen produkt. • b-gal: produkt gena lac. Z. Aktivnost merimo s pomočjo sintetičnih substratov, ki nosijo kromofor. Kvantificiramo spektrofotometrično. Manj uporabno zaradi celicam lastne galaktozidazne aktivnosti. Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Fluorescirajoči proteini • GFP (28 k. Da): • exc= 395 nm, 470 nm // em= 509 nm • variante GFP: raba kodona, prilagojena preiskovanemu organizmu, ojačanje signala (e. GFP) • druge barve: YFP, CFP, BFP omogočajo kolokalizacijske študije • pri GFP je kromofor v resnici na tripeptidu Ser-dehidro. Tyr-Gly imidazolidonski obroč http: //www. biochemtech. unihalle. de/PPS 2/projects/jonda/index. htm Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

EGFP: z mutacijo zapisa za GFP so dosegli ~30 x ojačanje signala; za detekcijo zadošča 100 n. M konc. (~10. 000 molekul/celico) Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

http: //www. dartmouth. edu/~dujs/2000 S/06 -Biolumen. pdf Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Transformacija celic • • Transformacija: naravna sposobnost nekaterih bakterij (ne E. coli), da sprejmejo tujo plazmidno DNA. - in vitro jo dosežemo s solnim in toplotnim šokom ali z elektroporacijo - pri evkariontih: spremembe v celični liniji, ki jih povzročijo tumorski virusi (maligna transformacija) Transdukcija: prenos genetske informacije med celicami s posredovanjem virusov Konjugacija: prenos delov kromosomske DNA med 2 (bakterijskima) celicama Transfekcija: vnos DNA v evkariontske celice (prehodna transfekcija) in njena kasnejša vključitev v kromosomsko DNA gostitelja (stabilna transfekcija) (tudi: okužba bakterij z golo fagno DNA) • Transpozicija: prenos DNA z enega dela kromosoma na drugega (tudi na drug genom) • Kompetentne celice: sposobne sprejeti tujo DNA - pripravimo jih s tretiranjem z različnimi solmi, predvsem Ca. Cl 2 - lahko jih zamrzujemo ob prisotnosti DMSO Postopek transformacije E. coli: kompetentnim celicam dodamo vektor in inkubiramo na ledu 30 min. , nato izvedemo toplotni šok (~1 min. 42 °C), ponovno ohladimo in dodamo rastni medij. Inkubiramo 1 h pri 37 °C, nato alikvot platiramo na plošče z ustreznim antibiotikom. • Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Fizikalni načini vnosa tuje DNA • Mikroinjiciranje • Koprecipitacija Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Elektroporacija http: //bme. pe. u-tokyo. ac. jp/research/ep/img/electroporation. jpg http: //www. talron. co. il/products/instr/cytopulse/transfecttech 1. htm Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Vnos z liposomi http: //biomed. uninet. edu/2004/n 2/suleymanoglu. html. Marko Dolinar, UL FKKT, 2005

Mikrobombardiranje (biolistika) Marko Dolinar, UL FKKT, 2005