PROTOCOLLO DI VALUTAZIONE DEL SEME Prof Giovanni Michele

PROTOCOLLO DI VALUTAZIONE DEL SEME Prof Giovanni Michele Lacalandra

SEME: fluido organico che contiene spermatozoi, secreti dalle gonadi maschili, e componenti fluide (plasma seminale) che originano dalle ghiandole sessuali accessorie, ovvero: vescicole seminali prostata ghiandole bulbo-uretrali

VESCICOLE SEMINALI Presenti nel toro, becco, ariete, stallone, verro, uomo; assenti nel cane. Producono: • Fruttosio: fonte di energia immediatamente disponibile per il movimento ed il metabolismo degli spermatozoi; • Acido citrico: interviene nei processi di liquefazione e coagulazione dello sperma, tramite captazione di cationi Ca 2+; • Inositolo: concorre al determinismo della pressione osmotica

PROSTATA Presente nel toro, becco, ariete (solo portio disseminata), stallone (solo corpo suddiviso in due lobi prostatici), verro, cane, uomo; • il suo secreto è più acido rispetto a quello vescicolare; • secerne enzimi (fosfatasi acida) e sostanze proteiche; • tali sostanze sono coinvolte nel determinismo del movimento flagellare

GHIANDOLE BULBO-URETRALI • presenti nel toro, nell’ariete, nel verro, nello stallone, nell’uomo; assenti nel cane; • nel verro il loro secreto costituisce il tappo gelatinoso che va a chiudere la cervice, dopo l’eiaculazione; • nella specie bovina il loro secreto igienizza il dotto uretrale, prima dell’eiaculazione vera e propria.

GHIANDOLE SESSUALI ACCESSORIE NELLE DIVERSE SPECIE Vescicole seminali Prostata Gh bulbouretrali

Contributi % dei differenti secreti ghiandolari nel volume totale dell’eiaculato Secreto prostatico Secreto ghiandole bulbo-uretrali Secreto vescicolare Toro 6 / 30 Ariete / / / Becco 6 / 8 Verro 30 40 / Stallone 30 / 30 Specie

FRAZIONI DELL’EIACULATO 1° frazione: rappresenta circa il 30 -40% del volume totale dell’eiaculato. Origina dalle ghiandole accessorie dell’apparato genitale (ghiandole di Cowper e Prostata) manca di spermatozoi, reazione leggermente acida, è ricca in elettroliti ed ha un’azione stimolante gli spermatozoi 2° frazione: rappresenta il 1530% dell’eiaculato. origina dalle ampolle di Henle e dell’epididimo. Ricca in spermatozoi. 3° frazione: rappresenta il 2030% dell’eiaculato. Proveniente dalle ghiandole vescicolari. Ricca in sostanze tampone, pertanto di protezione biologica nei confronti degli spermatozoi.

ESAME DEL SEME ESAME MACROSCOPICO: • volume • colore • densità • consistenza • odore • p. H ESAME MICROSCOPICO: • Concentrazione • Cinetica (motilità) • Durata della motilità • Citomorfologia • Rapporto vivi/morti

CARATTERI MACROSCOPICI DEL SEME VOLUME: la raccolta del seme dal collettore della vagina artificiale, si effettua in provette graduate COLORE: può variare da bianco traslucido a biancogrigiastro a bianco-crema. La colorazione giallastra è imputabile a pigmenti o xantine. Sono da escludere colorazioni verdastre (presenza di pus, quindi di infezioni latenti) o rosate (presenza di sangue per traumatismi all’apparato riproduttore del donatore

CARATTERI MACROSCOPICI DEL SEME • CONSISTENZA: da latteo-acquosa a latteo densa a latteo-cremosa, in relazione alla densità degli spermatozoi rispetto al volume di liquido testicolare, epididimario e delle ghiandole accessorie • ODORE: pressochè inodore • p. H: si valuta col p. H-metro

ASPETTO MACROSCOPICO DEL SEME NELLE DIVERSE SPECIE • Aspetto omogeneo • Opacità direttamente proporzionale alla densità spermatica • Seme con coaguli o frammenti di materiale organico: infezione • Colore giallo: Riboflavina (innocua) Probabile presenza di urina (in tal caso emette un peculiare odore)

ASPETTO MACROSCOPICO DEL SEME NELLE DIVERSE SPECIE • Aspetto bianco-lattiginoso con granuli che in cervice creano una massa compatta • Eiaculato diviso in più frazioni: Frazione pre-spermatica: aspetto traslucido Frazione spermatica: aspetto denso Frazione post-spermatica: simile alla pre-spermatica, ma meno traslucida e più densa • Volume medio per eiaculato: 250 m. L di cui: 20%: consistenza gelatinosa; 20 -30% spermatozoi 50 -60%: fluidi pre e post-spermatici

ASPETTO MACROSCOPICO DEL SEME NELLE DIVERSE SPECIE • Aspetto bianco-opaco o grigiastro • Frazionato, composto da una porzione mucogelatinosa (terza frazione dell’eiaculato) ed una liquida • Importante valutare qualità e quantità del campione di ogni singolo prelievo previa aspirazione della porzione muco-gelatinosa • Volume totale influenzato da: durata fase pre-copulatoria stagione (> in estate)

ASPETTO MACROSCOPICO DEL SEME NELLE DIVERSE SPECIE • Colore bianco-lattescente: fisiologico • Colore rosa: sangue per traumatismi sul pene per metodo errato di raccolta • Colore grigio o marrone: infezioni a carico del tratto riproduttivo • Colore giallo ed odore urinoso: presenza di urina a causa di raccolta con elettroeiaculazione • Volume seme influenzato da: • Metodo di raccolta(elettroeiaculazione dà volume >) • Età e stato di salute dell’ariete • Stagione di raccolta • Esperienza dell’operatore • Frequenza di raccolta • Volume totale varia da 0. 5 -0. 7 m. L nei soggetti giovani, fino a 2 m. L negli adulti

ASPETTO MACROSCOPICO DEL SEME NELLE DIVERSE SPECIE • Colorazione estremamente variabile, dal bianco-grigiastro al giallo, sia da un soggetto all’altro, che nello stesso soggetto, da un eiaculato ad un altro • Volume medio da 0, 5 a 1, 2 m. L.

ESAME MICROSCOPICO DEL SEME • A FRESCO, SU SEME TAL QUALE, SUBITO DOPO IL PRELIEVO • CON MATERIALE FISSATO E COLORATO

ESAME MICROSCOPICO DEL SEME A FRESCO Permette la valutazione della vitalità e della motilità degli spermatozoi. Sono note tre tecniche: • goccia pendente: ha l’inconveniente nella laboriosità della procedura e nell’ambiente poco idoneo per gli spermatozoi nella goccia situata tra il portaoggetto e il coprioggetto incavati; • goccia distesa: 2 -3 gocce vengono distese su vetrino portaoggetto con la pipetta pasteur; è un sistema utile per la valutazione dell’orientamento rispetto alla motilità e concentrazione degli spermatozoi; • goccia schiacciata: si pone il coprioggetto sul vetrino portaoggetto creando quindi una sottile pellicola di materiale spermatico nella quale gli spermatozoi possono muoversi liberamente. È il sistema migliore di osservazione in quanto è possibile effettuare osservazioni con corretta messa a fuoco degli obiettivi (anche ad immersione).

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CONCENTRAZIONE • La si può calcolare con tecniche MANUALI: AUTOMATICHE SEMI-MANUALI:

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CONTA MANUALE • Diluizione 1/20 – 1/100 del liquido seminale con uno spermicida (formalina, soluzione salina con bicarbonato o clorammina) • Si riempiono per capillarità le camere dell’ematocitometro (camera di Burker, Neubauer, di Thomas) • La camera di Burker è costituita da 9 quadrati grandi e 16 piccoli

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CONTA MANUALE • Si lascia sedimentare per 10 -30 minuti • Si procede a contare le teste degli spermatozoi contenute in 5 quadrati piccoli su 4 quadrati grandi nei due reticoli della camera di Burker • Moltiplico la media ottenuta per il fattore di diluizione, poi per un milione ed ottengo la concentrazione spermatica /m. L

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME CONTA MANUALE

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CONTA SEMIAUTOMATICA • Può effettuarsi con impiego del colorimetro, è un metodo pratico ed economico, sebbene approssimativo; ad oggi si impiega nella suinicultura, branca per cui non è necessaria una stima precisa della concentrazione degli spermatozoi

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CONTA SEMIAUTOMATICA • Può effettuarsi anche con spettrofotometro, un apparecchio che sfrutta la legge fisica per la quale, maggiore è la densità del mezzo che un raggio luminoso deve attraversare, minore è il raggio rifratto dallo stesso. La frequenza del raggio rifratto viene poi elaborata in codice colore dallo strumento.

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CONTA AUTOMATICA • Effettuata con un complesso analizzatore di immagini corredato di software, il Computer Assisted Sperm Analyzer (CASA). Tale strumento consente di valutare, oltre alla concentrazione, la motilità e la velocità degli spermatozoi.

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CINETICA Caratteristica fondamentale dello spermatozoo, poiché da essa dipendono: • Capacità attraversamento cervice • Capacità attraversamento giunzione uterotubarica • Capacità penetrazione cumulo ooforo • Capacità penetrazione zona pellucida

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CINETICA La motilità dello spermatozoo è funzione di: Proteine che sono acquisite durante la maturazione epididimale (Forward motility protein o FMP); Corretto rapporto tra la secrezione delle ghiandole accessorie (il secreto delle vescicole seminali inbisce, mentre quello prostatico stimola la motilità) Temperatura ed igiene del materiale di laboratorio con cui il seme viene a contatto

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CINETICA E’ la % di spermatozoi mobili che nei soggetti normali dovrebbe essere ≥ 70%. Si distingue in: Totale: identificazione degli spermatozoi vivi, quindi motili, nell’eiaculato (normalmente 7090%) Progressiva: confronto di una serie di misurazioni relative al moto degli spermatozoi

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CINETICA Velocità spermatica (basata su una scala arbitraria da 0 – statico, a 4 -rapido) Durata della motilità spermatica del seme intero (a temperatura ambiante 20 -25 °C) e diluito in extender (a temperatura ambiente oppure refrigerato a 4 -6 °C)

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CINETICA La velocità è alterata da: • Extender: generalmente l’aumenta e, nei primi 5 -10 minuti, induce gli spermatozoi ad un moto circolare • Shock termico: induce motilità di tipo circolare • Età degli spermatozoi: l’invecchiamento della cellula spermatica induce un moto oscillatorio.

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - MOTILITA’ TOTALE Viene effettuata con diversi metodi: Uso di colorazioni post-vitali: eosina-nigrosina, blu di bromofenolo, si legano alla membrana plasmatica degli spermatozoi morti (reazione cromocitologica) che appariranno colorati (es. all’eosina-nigrosina, gli spz morti appaiono rosa su un fondo azzurro). Metodo di gravammo: gli spermatozoi vengono fatti passare attraverso una colonna di Sephadex, contenente destrano. Gli spermatozoi morti, con membrana cellulare danneggiata, si legano al destrano e non passano nella colonna

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - MOTILITA’ PROGRESSIVA Valuta e compara registrazioni relative al movimento degli spermatozoi. Queste indagini possono essere effettuate manualmente o con l’ausilio di un computer. Valutazione manuale: si usano videoregistrazioni rallentate del movimento degli spermatozoi, visualizzate da osservatori che poi riportano manualmente, su un lucido, i vari movimenti visualizzati. E’ una tecnica laboriosa e pecca di soggettività. Valutazione computerizzata: si avvale del sistema CASA (Computerized Assisted Sperm Analyzer, che converte il segnale del moto registrato da una telecamera, in una matrice di punti.

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CASA PARAMETRI RELATIVI AL MOVIMENTO DEGLI SPERMATOZOI RILEVATI DAL CASA: La velocità lineare (VSL), data dalla distanza tra la prima e l’ultima posizione assunta dallo spermatozoo, diviso il tempo La velocità curvilinea (VCL) data dalla somma dei segmenti sottesi fra le varie posizioni della traiettoria degli spermatozoi, diviso il tempo La average path velocity (VAP) data dal rapporto tra la lunghezza della traiettoria dello spermatozoo ed il tempo L’ampiezza dello spostamento laterale della testa (AVL) Frequenza battito del flagello Spostamento angolare medio

PARAMETRI RELATIVI AL MOVIMENTO DEGLI SPERMATOZOI RILEVATI AL CASA TRAIETTORIA CURVILINEA TRAIETTORIA MEDIA SPOSTAMENTO RETTILINEO

PARAMETRI RELATIVI AL MOVIMENTO DEGLI SPERMATOZOI RILEVATI AL CASA Gli spermatozoi sono considerati motili per VAP > di un valore di riferimento imposto nel settaggio e variabile a seconda della specie. Motilità Totale: % di spermatozoi che superano la VAP rappresenta Motilità Progressiva: è data dalla differenza tra gli spermatozoi considerati motili totali ed il numero di spermatozoi con rapporto VSL/VAP < 80%. La motilità progressiva è espressa in numero spermi progressivamente motili (NSPM) Tali analisi sono attendibili se effettuate su almeno 4 campi microscopici e se valutano almeno 200 spz.

COME FUNZIONA IL CASA? Il singolo spermatozoo viene seguito nelle varie sequenze di registrazione. Il riconoscimento dello spermatozoo è legato alla stima dell’area delle sequenze successive ove è più probabile che esso si collocherà. Tale stima si evince dalla velocità media dello spermatozoo

ESAME MICROSCOPICO DEL SEME A FRESCO

ESAME MICROSCOPICO DEL SEME A FRESCO CAMPIONE DI SEME FRESCO DI PAPPAGALLINO ONDULATO

ESAME MICROSCOPICO DEL SEME FISSATO E COLORATO

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CITOMORFOLOGIA - SPERMATOZOI BOVINI

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CITOMORFOLOGIA - SPERMATOZOI DI CAVALLO

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME - CITOMORFOLOGIA - SPERMATOZOI DI CANE

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME EQUINO - CITOMORFOLOGIA - ANOMALIE TESTA SPERMATOZOI NORMALI ANOMALIE PEZZO INTERMEDIO ANOMALIE CODA ANOMALIE COLLO

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME EQUINO - CITOMORFOLOGIA - g. lacalandra -2003 44

CARATTERI MICROSCOPICI DEL SEME CANINO - CITOMORFOLOGIA -

Tracciati di motilita’ spermatica appartenenti a soggetti sub-fertili o infertili Caratteristiche della motilità e morfologia Flagello Testa Movimenti spermatici progressivi Movimento vibratorio e circolare Lento o rapido tremolio da parte; vibrazioni di vario tipo e frequenza a forma di curva; immotile Immotile o vibrante Motilità senza progressione; movimento perpendicolare, obliquo o orizzontale in senso orario o antiorario Sfrecciante Movimento vibratorio ad alta velocità Irregolare; propulsivo; non rotatorio Minimi e irregolari; tracciati erratici Rotatorio Movimenti ondulatori del Tutto lo spz ruota intorno flagello di modesta entità al proprio asse; periodico effetto “a intermittenza” Rapido movimento progressivo in linea retta Asimmetria della testa e/o del flagello Ampiezza asimmetrica dei movimenti del flagello da entrambe le parti Irregolare; propulsivo, assenza di moto rotatorio Orbite circolari se la rotazione è assente Spermatozoi con goccia citoplasmatica Movimenti oscillatori e disuguali Irregolare, oscillante; rotatorio spesso raramente Perpendicolare, obliquo, raramente progressivo Spermatozoi agglutinati Lenti movimenti vibratori Lenti, irregolarmente progressivi, oscillanti In funzione del tipo di agglutinazione

TABELLA RIASSUNTIVA DI ALCUNI PARAMETRI SPERMATICI N° spermatozi /eiaculato (x 109) Volume (ml) Concentrazione 5 -8 1 -1, 5 12 75 95 6, 5 -6, 8 Ariete 1 3, 0 3 95 95 6, 85 Verro 200 0, 25 50 70 90 7, 3 -7, 9 70 -80 0, 15 12 70 40 -90 7 -7, 8 Cane 1 -40 ml 0, 2 variabile 70 70 Gatto 0, 02 -0, 12 0, 00015 -0, 0013 variabile 60 -90 90 Uomo 2 -6 0, 15 0, 9 65 30 - 0 Specie Toro Stallone (x 109/ml) % % Mobili Normali p. H

ANALISI DEL SEME - NOMENCLATURA Parametro Criteri di valutazione Definizione Volume Assente Ridotto Aumentato Aspermia Ipospermia Iperspermia Concentrazione spermatica Zero Ridotta Normale Aumentata Azoospermia Oligozoospermia Normozoospermia Polizoospermia Motilità spermatica Diminuita Astenozoospermia Vitalità spermatica Tutti gli spermatozoi sono morti Necrozoospermia Anomalie spermatiche Elevata percentuale Teratozoospermia

DILUIZIONE DEL SEME La diluizione del seme serve a: Ottenere un numero elevato di dosi inseminative da un solo eiaculato; Garantire il congelamento del seme prevenendo eccessive alterazioni morfo-funzionali degli spz, incompatibili con la vita.

DILUIZIONE DEL SEME • Se si desidera utilizzare il seme per l’inseminazione subito dopo il suo prelievo, esso va diluito con mestruo diluitore in rapporto di 1: 1 o 1: 3. • Se si intende effettuare l’inseminazione più tardivamente, il seme deve andare incontro ad una maggiore diluizione.

DILUIZIONE DEL SEME Un diluitore è una sostanza bio-compatibile col seme e presenta le seguenti caratteristiche: • Isotonico con le cellule seminali • Dotato di sistema tampone per prevenire l’eccessiva acidificazione del mezzo • Dotato di capacità protettive nei confronti delle membrane cellulari • Dotato di capacità nutritive • Addizionato con antibiotici a potere batteriostatico/battericida • Dotato di un crioprotettore per controllare la formazione di cristalli di ghiaccio

DILUIZIONE DEL SEME Qui di seguito sono elencate alcune sostanze che rientrano nella costituzione dei diluitori: • -Citrato trisodico, Acido citrico • -Latte scremato trattato termicamente (Laiciphos) • -TRIS (idrossimetil-aminometano) • -Tuorlo d’uovo (20%) • -Zuccheri (fruttosio, lattosio) • -Antibiotici (Penicillina/Streptomicina/Lincomicina/Spectinomicina) • -Crioprotettore (Glicerolo a concentrazione diversa)

PRESSIONE OSMOTICA Bonadonna nel 1949 considerava sufficienti per prevenire gli incidenti da pressione osmotica, l’impiego di sostanze 0, 8 e 1%, elettrolitiche comprese fra lo che daranno soluzioni perfettamente tollerate dagli spermatozoi, tenendo conto che, negli eiaculati di maggiore concentrazione e scarso volume (toro, arieti ed uccelli), la loro povertà in elettroliti permette di utilizzare liquidi di concentrazione un poco maggiore; al contrario, con l’eiaculato proveniente da animali ad eiaculazione intrauterina (cavallo, cane e maiale) bisogna essere cauti a ridurre al minimo l’aggiunta di elettroliti al plasma seminale, già ricco in questi elementi. g. lacalandra -2003 53

APPORTO DI MATERIALE ENERGETICO 1. La principale fonte di energia per gli spermatozoi è rappresentata dagli zuccheri. Lo spermatozoo, come altre cellule, è capace di metabolizzare gli idrati di carbonio, mediante: • meccanismo ossidativo aerobico, dal quale restano come residui CO 2 ed H 2 O • meccanismo anaerobico, o di degradazione incompleta, nel quale il ciclo termina nella fase di acido lattico che si accumula. g. lacalandra -2003 54

TUORLO D’UOVO La composizione del tuorlo è la seguente: Acqua: 48%; Grassi: 23%; Albuminoidi: 15, 27%; Lecitine: 10, 7%; Colesterina: 1, 7%; Minerali e pigmenti: 0, 9% Il tuorlo d’uovo si comporta come un agente meccanico che tappezza la cellula spermatica con una speciale vernice di protezione contro l’acidità e agenti nocivi di diversa natura con cui possono trovarsi gli spermatozoi nell’apparato genitale femminile, così come contro le variazioni termiche la refrigerazione e/o il congelamento dello sperma richiede. Il tuorlo d’uovo da un lato stimola il metabolismo del glucosio (più che quello del fruttosio), dall’altro aumenta nel mestruo l’acido lattico, che può arrivare a costituire una causa biologica di necrospermia. Da qui la necessità di associare all’aggiunta del tuorlo sostanze ad azione tampone. g. lacalandra -2003 55

SOLUZIONI FOSFATATE • In principio si osservò che la migliore combinazione tamponante per i mestrui era proprio la risultante dell’associazione di fosfato sodico e potassico. In effetti in questo modo si ottiene un perfetto equilibrio biologico fra ciascuno dei cationi sodio e potassio. • Per la preparazione del mestruo si mescolano i tuorli con la soluzione di fosfato. • Le soluzioni impiegate da MADISON erano formate da 2 g di PO 4 HNa 2 diluiti in 100 ml d’acqua bidistillata. Le soluzioni di fosfato così impiegate esercitano un’azione tampone stabilizzando il p. H intorno a 7, circostanza molto importante per evitare l’azione nociva che, per accumulo di acido lattico, si produrrebbe altrimenti sugli spermatozoi. g. lacalandra -2003 56

SOLUZIONI CITRATO SODICO (Salisbury) • Pare che il tuorlo d’uovo in contatto con la soluzione citrato sodico si comporti in modo alquanto differente rispetto a quanto si verifica nei confronti delle soluzioni fosfato. • Il citrato sodico aumenta la capacità di diluizione del tuorlo nel mezzo liquido, fenomeno che favorisce l’azione del tuorlo sugli spermatozoi. • In termini generali il tuorlo d’uovo in soluzione citrato, fa aumentare la capacità fecondante dello sperma. g. lacalandra -2003 57

VARI TIPI DI DILUITORI (per FA con seme refrigerato) 1. DILUITORE AL LATTE: latte intero omogenizzato e bollito per 20’/98°C, oppure con latte in polvere più penicillina/streptomicina 2. DILUITORE IVT: (Illini Variable Temperature) con aggiunta di CO 2 per bloccare il processo fruttolitico, consentendo una buona conservabilità anche a 5 gg. 3. DILUITORE SEMINALE NEOSEMINAN: danno una eccellente omogenizzazione con sedimentazione assente per una buona visione microscopica e circa il 75% di gravidanza dopo fecondazione a 5 gg. dal prelievo; ATTUALMENTE LA FECONDAZIONE CON SEME FRESCO E L’UTILIZZO DI TALI DILUITORI VIENE EFFETTUATA SOLO PER IL CONTROLLO DEI RIPRODUTTORI IN QUANTO SOPPIANTATA DALLA FECONDAZIONE CON SEME CONGELATO. g. lacalandra -2003 58

MESTRUI DILUITORI COMUNEMENTE IMPIEGATI NEL CAVALLO Mestruo di Kenney 1 Miscelare latte in polvere privo di grassi (2, 4 g) e glucosio (4, 9 g) in 92 ml di acqua deionizzata 2 Aggiungere streptomicina solfato in polvere (150000 μg) oppure gentamicina solfato (100 mg) miscelata con 2 m. L di una soluzione di bicarbonato di sodio al 7, 5% Mestruo modificato di Kenney 1 Miscelare latte in polvere privo di grassi (24 g), glucosio (27 g) e saccarosio (40 g) in 907 m. L di acqua deionizzata 2 Aggiungere penicillina G potassica (1. 000 unità) e kanamicina solfato (1 g) Continua…. .

MESTRUI DILUITORI COMUNEMENTE IMPIEGATI NEL CAVALLO Mestruo con latte magro 1 Riscaldare 100 m. L di latte scremato (senza additivi) a 9295°C per 10 minuti in un bollitore. Raffreddare. 2 Aggiungere polimixina B solfato (100. 000 unità) Mestruo con crema-gel 1 Disciogliere 1, 3 g di gelatina animale in 10 m. L di acqua deionizzata. Sterilizzare 2 Riscaldare Half & Half crema a 85 -92 °C per 2 -4 min in un bollitore. Rimuovere la schiuma dalla superficie. 3 Miscelare la soluzione di gelatina con 90 m. L di crema half & Half riscaldata (portare a 100 m. L di volume totale). Raffreddare. 4 Aggiungere penicillina G in polvere (100. 000 unità), streptomicina solfato (100. 000μg ) e polimixina B solfato (20. 000 unità) Continua…. .

MESTRUI DILUITORI COMUNEMENTE IMPIEGATI NEL CAVALLO Mestruo modificato Cremagel (Formula Neely) 1 Riscaldare Half & Half crema a 85 -92 °C in una fisca di vetro per 10 minuti. Rimuovere la schiuma dalla superficie. 2 Disciogliere 6 g di gelatina animale in 40 m. L di destrosio al 5% e riscaldare a 65°C in bagnomaria. 3 Aggiungfere la soluzione di gelatina calda alla crema. Coprire e far raffreddare a 3540 °C. 4 Aggiungere penicillina G potassica (1. 000 unità) e solfato di kanamicina (0, 5 g)

MESTRUO PER SEME DI ARIETE A BASE DI TUORLO D’UOVO, TRIS E FRUTTOSIO Componenti Quantità Tris (idrossimetil) aminometano 3, 6 g Fruttosio 0, 5 g Acido citrico monoidrato 1, 99 g Tuorlo d’uovo 14 m. L Acqua distillata Aggiungere fino a un volume di 100 m. L

DILUIZIONE DEL SEME Alcuni diluitori presenti sul mercato:

DILUIZIONE DEL SEME Alcuni diluitori presenti sul mercato:

Grazie Prof Giovanni Michele Lacalandra