IL CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEI PRODOTTI COSMETICI Cosmetico Prodotto

IL CONTROLLO MICROBIOLOGICO DEI PRODOTTI COSMETICI

Cosmetico: Prodotto per uso topico, privo di attività farmacologica, atto a migliorare temporaneamente la parte del corpo trattata. Prodotti cosmetici: profumi, deodoranti, creme per corpo e viso (idratanti, nutrienti, etc), prodotti per make up, dentifrici, colluttori, detergenti intimi, detergenti corpo, shampoo, balsami capelli, prodotti professionali per tricologia. Prodotti “border line”: lavande intime, sistemi che prevedono applicazione su cute lesa, prodotti per trattamento inestetismi (patologie quali acne, couperose, cellulite).

La legge 713 (11 Ottobre 1986) e successive modifiche (D. LGS 50/2005) hanno regolato fino al 2013 la produzione dei prodotti cosmetici: Art. 1 Comma 1 “Per prodotti cosmetici si intendono le sostanze e le preparazioni, diverse dai medicinali, destinate ad essere applicate sulle superfici esterne del corpo umano (epidermide, sistema pilifero e capelli, unghie, labbra, organi genitali esterni), oppure sui denti e sulle mucose della bocca allo scopo, esclusivo o prevalente, di pulirli, profumarli, modificarne l’aspetto, correggere gli odori corporei, proteggerli o mantenerli in buono stato”. Comma 2 “I prodotti cosmetici non hanno finalità terapeutiche e non possono vantare attività terapeutiche”. Comma 3 “Sono in particolare prodotti cosmetici, ai sensi dei commi precedenti, i prodotti che figurano nell’allegato I …”

Allegato I Elenco indicativo per categoria dei prodotti cosmetici - Creme, emulsioni, lozioni, gel e oli per la pelle (mani, piedi, viso, ecc. ) - Maschere di bellezza (ad esclusione dei prodotti per il peeling) - Fondotinta (liquidi, paste, ciprie) - Cipria per il trucco, talco per il dopobagno e per l'igiene corporale, ecc. - Saponi di bellezza, saponi deodoranti, ecc. - Profumi, acque da toletta ed acqua di colonia - Preparazioni per bagni e docce (sali, schiume, oli, gel, ecc. ) - Prodotti per la depilazione - deodoranti ed antisudoriferi - Tinture per capelli e decoloranti - Prodotti per l'ondulazione, la stiratura e il fissaggio - Prodotti per la messa in piega - Prodotti per pulire i capelli (lozioni, polveri, shampoo) - Prodotti per mantenere i capelli in forma (lozioni, creme, oli) - Prodotti per l'acconciatura dei capelli (lozioni, lacche, brillantine) - Prodotti per la rasatura (saponi, schiume, lozioni, ecc. ) - Prodotti per il trucco e lo strucco del viso e degli occhi - Prodotti destinati ad essere applicati sulle labbra - Prodotti per la cura dei denti e della bocca - Prodotti per la cura delle unghie e lacche per le stesse - Prodotti per cure intime esterne - Prodotti solari - Prodotti abbronzanti senza sole - Prodotti per schiarire la pelle - Prodotti antirughe

Art. 7 Comma 1 “I prodotti cosmetici devono essere fabbricati, manipolati, confezionati e venduti in modo tale da non causare danni per la salute nelle normali condizioni di impiego. . . ” Comma 2 “Il Ministero della Sanità, tenendo conto delle direttive Comunitarie, determina i metodi di analisi necessari per controllare la composizione dei prodotti cosmetici ed altresì i criteri di purezza batteriologica e chimica e relativi metodi di controllo, nonché, se del caso, particolari prescrizioni per la conservazione.

Purezza microbiologica del cosmetico Per quanto riguarda la purezza microbiologica del cosmetico non esistono limiti ufficiali. Il cosmetico infatti generalmente si applica in parti del corpo in cui è presente flora microbica. La direttiva 76/768/CEE (27 luglio 1976) del Parlamento Europeo sancisce che, per la garanzia della salute del consumatore è necessario che la carica microbiologica del cosmetico sia mantenuta ai livelli più bassi, che non siano rilevabili microrganismi patogeni e che tale condizione sia stabile nel tempo.

Dall’ 11 luglio 2013 è entrata in vigore la nuova direttiva europea 1223/2009/CE che riassume le varie modifiche effettuate negli anni e … “… prevede norme chiare e dettagliate, che non lasciano spazio a divergenze nel recepimento da parte degli Stati membri. Il regolamento garantisce inoltre che le prescrizioni giuridiche siano attuate contemporaneamente in tutta la Comunità. ” Articolo 1. Ambito di applicazione e obiettivo Il presente regolamento stabilisce norme che ogni prodotto cosmetico immesso sul mercato deve rispettare, al fine di garantire il corretto funzionamento del mercato interno ed un livello elevato di tutela della salute umana. Articolo 8. Buone pratiche di fabbricazione 1. Nella fabbricazione di prodotti cosmetici sono rispettate le buone pratiche di fabbricazione al fine di garantire il raggiungimento degli obiettivi di cui all’articolo 1. 2. Qualora la fabbricazione avvenga conformemente alle pertinenti norme armonizzate, i cui riferimenti sono stati pubblicati nella Gazzetta ufficiale dell’Unione europea, si presume il rispetto delle buone pratiche di fabbricazione. ISO 22716 - Pratiche di Buona Fabbricazione dei cosmetici (GMP)

Di cosa si deve occupare il laboratorio per produrre un cosmetico di qualità? Sicuro per il consumatore: test attualmente applicati sono a) test in vivo sull’uomo “patch test”; b) test in vitro su colture cellulari che sono più selettivi per irritazioni oculari e a carico delle mucose. Stabile e compatibile con il pack primario: procedure proprie del laboratorio per testare tramite invecchiamento accelerato (permanenza in stufa o shock termici) la conformità alle caratteristiche originali nel tempo Deve soddisfare i requisiti normativi: relativi al paese d’origine e a quelli dove verrà commercializzato. Protetto dalle contaminazioni batteriche e micotiche: sulla base della tipologia del formulato (valutazione dell’acqua libera, p. H del finito, presenza di elementi inibenti o favorenti la crescita batterica) e della tipologia del pack primario, il formulatore utilizza l’opportuno sistema conservante. La reattività del conservante viene testata presso laboratori di microbiologia mediante “challenge test” (inoculo di colonie batteriche o micotiche) e monitoraggio nel tempo

I test clinici Patch test Obiettivo del patch test è valutare la compatibilità cutanea di cosmetici destinati a venire a contatto con la cute umana. Le condizioni di utilizzo vengono esasperate (patch occlusivo fino a 24 ore) allo scopo di confermare che il prodotto non sia irritante nelle normali o ragionevolmente prevedibili condizioni d’uso.

Test di irritazione Il test di irritazione viene effettuato per valutare il potenziale irritativo oculare o dermico, seguendo protocolli differenti che utilizzano valutazioni in vitro in sostituzione ai test sugli animali (in genere conigli). “…gli esperimenti su animali siano sostituiti da metodi alternativi, laddove essi esistano e siano scientificamente validi” (direttiva 86/609/CEE 24/11/1986, art. 7). I protocolli utilizzati sono il test di Irritazione e i Saggi di Citotossicità e di proliferazione cellulare.

Irritection test Test in vitro effettuato su una matrice che simula i fenomeni biochimici responsabili della opacizzazione corneale o le alterazioni dermiche osservati nei test in vivo.

Saggi di citotossicità e proliferazione cellulare Test in vitro condotto su colture cellulari (fibroblasti, cheratinociti, cornee) volto a stabilire l’IC 50 ovvero la concentrazione di prodotto cosmetico che induce una riduzione della vitalità cellulare del 50% rispetto alle cellule non trattate. Test MTT (3 -(4, 5 -dimetiltiazol-2 -yl)-2, 5 -difeniltetrazolio bromide): saggio di proliferazione cellulare. Saggio colorimetrico per la misurazione dell'attività degli enzimi mitocondriali che riducono l'MTT a formazano. Attività enzimatica soltanto nelle cellule vive e consiste nel taglio dell'anello di tetrazolio dell'MTT (sostanza di colore giallo) con la formazione di formazano (un sale blu). Tale reazione è valutata e misurata mediante la lettura spettrofotometrica del campione alla lunghezza d'onda di 570 nm.

La stabilità microbiologica: requisito fondamentale dei cosmetici

Contaminazione microbica dei cosmetici RISCHI: • Contagio e diffusione di infezioni e malattie connesse alla contaminazione microbica • Tossicologici e allergologici inerenti alla presenza di metaboliti microbici • Instabilità chimico-fisica del prodotto (causata da eventuale presenza di microrganismi)

L’obiettivo dell’analisi microbiologica: microbiologica determinare in maniera qualitativa e quantitativa i microrganismi vitali presenti in un campione, verificando l’assenza di specie microbiche ritenute patogene. UNI ISO 21148: 2009 Cosmetici - Microbiologia - Istruzioni generali per l'analisi microbiologica UNI ISO 21149: 2009 Cosmetici - Microbiologia - Conta e ricerca dei batteri mesofili aerobi UNI ISO 18416: 2009 Cosmetici - Microbiologia - Ricerca di Candida albicans UNI ISO 21150: 2009 Cosmetici - Microbiologia - Ricerca di Escherichia coli UNI ISO 22717: 2009 Cosmetici - Microbiologia - Ricerca di Pseudomonas aeruginosa UNI ISO 22718: 2009 Cosmetici - Microbiologia - Ricerca di Staphylococcus aureus

Metodi di conta diretta e di isolamento Dopo circa 24 h dallo scarico del prodotto è necessario valutare la presenza di unità formanti colonia (batteri o miceti). prodotti classici prodotti particolari Batteri <100 ufc Miceti <10 Patogeni assenti <10 assenti “Prodotti particolari” sono considerati quelli destinati al contorno occhi, all’igiene intima, prodotti per bambini

Procedure di mantenimento e manipolazione del campione: - - analizzare i campioni il prima possibile, altrimenti mantenere i campioni a temperatura ambiente fino al momento dell’analisi. Non refrigerare o congelare i campioni; controllare attentamente i campioni prima di aprirli e prendere nota di qualsiasi irregolarità rilevata nel contenitore; disinfettare la superficie del contenitore con una miscela acquosa di etanolo (70%) e HCl (1%) o altri disinfettanti (4% iodio in 70% etanolo o soluzione di gluteraldeide al 2%) e asciugare con garza sterile prima dell’apertura; lavorare in ambiente sterile (cappa a flusso laminare); usare una parte rappresentativa del campione da analizzare (es. 1 g o 1 ml di campione, se il peso del prodotto inferiore analizzare l’intero contenuto).

Preparazione preliminare del campione: Campione liquido: diluire 1 ml di campione in 9 ml di brodo coltura; Campione solido o in polvere: prelevare asetticamente 1 g di campione in 1 ml di Tween 80, mescolare e aggiungere 8 ml di brodo coltura; Crema o prodotti a base di olio: prelevare asetticamente 1 g di campione in 1 ml di Tween 80 con 5 -7 biglie di vetro di 5 mm, vortexare e aggiungere 8 ml di brodo coltura. Prodotti in aerosol (polveri, saponi, liquidi): disinfettare l’erogatore con garza bagnata con etanolo (70%). Eliminare il primo campione fuoriuscito dallo spray. Erogare una quantità di spray pari a 1 g di prodotto in 9 ml di terreno.

Conta microbica Il numero di colonie per piastra deve essere compreso tra 25 -250

Conta microbica utilizzando penna conta colonie Conta microbica utilizzando lente d’ingrandimento

• Batteri aerobi • Funghi • Batteri anaerobi (solo per talchi e polveri)

Ricerca microrganismi specifici: Staphylococcus aureus • COCCHI GRAM+, IN GRAPPOLI, IMMOBILI, ASPORIGENI, AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI, CATALASI e COAGULASI+ • MOLTO DIFFUSI, MA PARTICOLARMENTE CONCENTRATI SULLA CUTE, PIU’ RARAMENTE NELLA FARINGE E PRIME VIE AEREE • Conferma identificazione: colorazione di Gram, test della coagulasi, test della catalasi (in presenza di catalasi il H 2 O 2 è scisso in H 2 O e O 2 gassoso)

Pseudomonas aeuriginosa • BACILLI GRAM-, MOBILI PER FLAGELLI POLARI • CAPSULATO • POSITIVI AL TEST DELL’OSSIDASI (PRESENZA DI CITOCROMO OSSIDASI) • Conferma identificazione: colorazione di Gram; test dell’ossidasi: utilizzo del diidrocloruro di p-fenilendiamina (come accettore di elettroni) che in presenza di ossigeno e citocromo ossidasi = colore blu entro pochi secondi. Microrganismo che sopravvive nei cosmetici utilizzati a livello oculare quindi pericolo di infezioni all’occhio.

Escherichia coli • BACILLI GRAM-, ASPORIGENI, MOBILI PER FLAGELLI PERITRICHI, AEROBI-ANAEROBI FACOLTATIVI • • NEGATIVI AL TEST DELL’OSSIDASI UTILIZZANO IL GLUCOSIO PER (PRODUZIONE DI ACIDI E/O GAS) POSITIVI AL TEST DELL’INDOLO • VIA FERMENTATIVA • Conferma identificazione: colorazione di Gram, fermentazione carboidrati, produzione di indolo (triptofanasi trasforma il triptofano in indolo che in presenza di p-dimetilamino-benzaldeide forma un complesso rosso Kit commerciali es API 20 E

Batteri anaerobi Clostridium tetani BACILLO, GRAM+, ANAEROBIO OBBLIGATO SPORIGENO Giara per anaerobiosi Kit generatore di CO 2 e H 2 e indicatori di anaerobiosi Pompa a vuoto Cappa per anaerobiosi L’allontanamento di aria si può ottenere: - nella giara utilizzando una busta contenente boroidruro di sodio, acido tartarico e bicarbonato di sodio e aggiunta di acqua. La busta libera CO 2 e H 2, consumo di O 2 presente e formazione di H 2 O; - aggiunta al terreno di coltura sostanze riducenti (cisteina, acido ascorbico, glutatione) e ebollizione e successivo raffreddamento per eliminare O 2

CANDIDA ALBICANS - LIEVITO - PATOGENO OPPORTUNISTA - COMMENSALE ABITUALE DELLA CUTE E DELLE MUCOSE DELLE CAVITA’ NATURALI DELL’UOMO TERRENO DI COLTURA: SABOURAUD ALLA GENTAMICINA Conferma: esame morfologico delle colonie

Come evitare la contaminazione microbica: • Riduzione dell’acqua libera e disponibile nel cosmetico in fase di progettazione • Controllo microbiologico operando secondo le “norme di buona fabbricazione” • Aggiunta di un sistema conservante al cosmetico finito

Per ottenere un prodotto cosmetico microbiologicamente stabile è necessario concentrarsi sulla prevenzione dalla contaminazione microbica che può essere realizzata tenendo sotto controllo: -materie prime (con particolare attenzione verso: acqua, ingredienti ricchi in acqua o contenenti peptidi o aminoacidi, polveri inorganiche possono rappresentare un buon substrato di crescita per i vari microrganismi); -impianti di produzione e di confezionamento (periodica e regolare sanitizzazione con sostanze specifiche); -ambienti di lavoro (devono essere mantenuti adeguatamente puliti tramite l’applicazione di norme igieniche definite e l’impiego di personale specializzato per i laboratori di produzione); -materiali di confezionamento (packaging) che potrebbero veicolare microrganismi direttamente nel prodotto; -prodotto cosmetico (corretta conservazione verificata tramite analisi microbiologiche, challenge test, in use test ed altre analisi specifiche).

UNI EN ISO 22716: 2008 Cosmetici - Pratiche di buona fabbricazione (GMP) Linee guida sulle pratiche di buona fabbricazione Per garantire conformità microbiologica occorre che tutta la filiera produttiva sia controllata: - macchinari e attrezzature: in acciaio inox 316 lucidato a specchio; assenza di angoli o fessure dove si annida sporcizia; cleaning in place; - le macchine devono essere lavate e sanitizzate e controllate a spot (conta microbica sull’acqua dell’ultimo risciacquo, tamponi, piastre di contatto). Nei periodi di inattività non ci devono essere ristagni di acqua e al momento del nuovo utilizzo devono essere pulite e sanitizzate nuovamente; - metodi di sanitizzazione di tipo chimico (da alternare per non favorire resistenze: x es. acido peracetico e benzalconio cloruro) o fisico (calore, esposizione lampade UV);

- personale addetto deve seguire percorsi prestabiliti che comprendano locali per il cambio degli indumenti e delle calzature; - locali di lavoro e di stoccaggio a temperatura controllata e ventilazione forzata; - pavimenti ideali sono strati uniformi di materiale sintetico, con limitati punti di giunzione (zone crescita microbica) con parti di pendenza e scarichi dell’acqua di lavaggio; - controllo di eventuale presenza di animali volatili (lampade UV) o striscianti (trappole).

Prevenire la contaminazione “Ci sono svariati modi per i cosmetici di venire a contatto con batteri che sono presenti perfino nelle case più pulite. Anche il calore e il vapore nel bagno, dove i cosmetici vengono maggiormente usati e tenuti, favoriscono la crescita dei batteri. Senza i conservanti, i cosmetici dovrebbero essere mantenuti a freddo e si rovinerebbero allo stesso modo dei cibi deperibili. Trattare i cosmetici come cibo fresco sarebbe molto costoso e sconveniente per i consumatori – installare un frigorifero in bagno non è un’opzione pratica. . . ” “Una piccola quantità di conservante può proteggere i cosmetici dalla contaminazione per un lungo periodo. Grazie ai conservanti, i consumatori possono stare tranquilli che i loro prodotti cosmetici sono sicuri da utilizzare. ” La maggior parte dei cosmetici necessita di conservante, inclusi i prodotti fatti con ingredienti naturali come la polpa di frutta, gli estratti dalle piante, l’olio di jojoba. Ci sono poche eccezioni — profumi, deodoranti e spray per capelli con alto contenuto di alcool.

valutazione del rischio di contaminazione • Il rischio di contaminazione può dipendere: • dalla composizione chimica e presenza di preservanti: Gruppo 1: prodotti a rischio elevato, facilmente contaminabili e provvisti di sistema preservante. Gruppo 2: prodotti a rischio medio, contaminabili ma che permettono una scarsa moltiplicazione microbica. Gruppo 3: prodotti a basso rischio per assenza di acqua o per la presenza di sufficiente quantità di alcool.

• dal tipo di confezionamento: - contenitori multiuso dove può verificarsi il contatto ripetuto con acqua o mani sporche; - contenitore multiuso quando il contatto con acqua e mani sporche è limitato, ad esempio per la presenza di un dispenser; - prodotti monouso

Valutazione del rischio di contaminazione legato al tipo di packaging e al fattore uso/abuso del prodotto da parte del consumatore RDV = valore D massimo accettabile per il microrganismo target _______________________ (fattore packaging) (fattore uso/abuso da parte consumatore) valore D: il tempo espresso in ore necessario ad abbattere di 1 logaritmo ovvero del 90% la carica microbica inoculata

Fattore packaging Fattore di rischio Tipo packaging e chiusura 1 basso -Prodotti o applicatori monouso -Contenitori monodose -Contenitori sigillati ermeticamente 5 moderato -Contenitori multi-uso se contatto con acqua o dita umide/sporche poco probabile -Lozioni in dispenser -Creme in tubo con tappo a vite o flip-top 10 alto -Contenitori multi-uso contatto ripetuto con acqua o dita umide/sporche -Shampoo/balsamo in dispenser o tubi con tappo a vite o flip-top -Dentifricio nel tubo con tappo a vite o flip-top -Creme in vasetto con pattina removibile -Ombretto/mascara con applicatore riutilizzabile (spazzolino, pennellino, tamponcino)

Fattore uso/abuso da parte consumatore Fattore di rischio Tipo packaging e chiusura 1 basso Utilizzo di prodotti o applicatori monouso Es. - Shampoo in contenitori monodose; - liquidi in bustine o pacchetti in plastica monodose 5 moderato Utilizzo di prodotti multi-uso se contatto con acqua o dita umide/sporche occasionale Es. - Toccare lo sbocco esterno dell’erogatore; - toccare la punta del tubetto mentre la crema viene erogata sulle dita 10 alto Utilizzo di prodotti multi-uso contatto ripetuto con acqua o dita umide/sporche Es. - Rimuovere tappo dal flacone di shampoo durante la doccia; - bagnare o inumidire lo spazzolino del mascara e reintrodurlo nel prodotto; - aggiungere acqua ad un flacone di sapone liquido o gel doccia per raccogliere tutto il prodotto residuo e utilizzarlo diluito in più giorni

UNI EN ISO 22715: 2007 Cosmetici - Imballaggio ed etichettatura Regolamento (CE) n. 1223/2009 (Art. 19 comma 1) • Nell’ottica di una maggiore tutela del consumatore, è stato inserito l’obbligo di apporre sui contenitori la data di durata minima dei prodotti cosmetici che prevede mese e anno (a volte anche giorno, mese e anno). • Per i prodotti con durata minima superiore ai 30 mesi la data non è richiesta ma viene introdotto il concetto di: Period After Opening (PAO) “la data fino alla quale il prodotto, opportunamente conservato, continua a soddisfare la sua funzione iniziale e non causa danni alla salute del consumatore se applicata nelle normali condizioni d’uso” “si compone nell’ordine: del mese e dell’anno, oppure del giorno, del mese e dell’anno” 6 M

Il Challenge Test consiste nel riprodurre in laboratorio l’aggressione microbica che può essere subita da un prodotto durante la sua vita. Esso consiste nell’inoculare con microrganismi adatti una determinata preparazione di prodotto, al fine di verificare mediante campionamenti ad intervalli di tempo prefissati, la quantità di microrganismi presenti. Ciò permette di verificare la resistenza intrinseca del prodotto allo sviluppo di microrganismi e l’efficacia del sistema conservante facente parte della formulazione. Può essere effettuato durante il processo produttivo (challenge test di processo) processo o sul prodotto finito per valutare il PAO (challenge test di prodotto). prodotto

Vengono utilizzati microrganismi rappresentativi delle specie microbiche possono contaminare il prodotto e allo stesso tempo siano potenziali patogeni per l’utilizzatore finale: Gram positivi (Staphylococcus aureus ATCC 6538); Gram negativi (Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Escherichia coli ATCC 8739); lieviti (Candida albicans ATCC 10231); muffe (Aspergillus niger ATCC 16404). Durata di 28 giorni con cinque verifiche periodiche a tempi prestabiliti e sono richiesti specifici parametri di riduzione logaritmica della carica microbica inoculata che deve essere: -almeno superiore a 1. 0 x 106/ml per batteri Gram positivi e Gram negativi; -superiore a 1. 0 x 105/ml per lieviti e miceti.

Preparazione dell’inoculo contaminante: • Sviluppo in idoneo terreno di coltura per 24 -28 h a 25°C-30°C • Eliminare il terreno tramite centrifugazione • Lavare e centrifugare • Sospendere il pellet portando la carica microbica a una concentrazione finale di 105 -106 microrganismi/ml

• Mescolare il prodotto con l’inoculo • Diluire le sospensioni dei diversi tempi con acqua peptonata aggiungendo eventualmente Tween 80 • Inoculare in opportuno terreno e incubare a temperatura (22 -35°C) • Controllare le cariche microbiche a diversi tempi di incubazione (0 h, 1 h, 24 h, 3 gg, 7 gg, 28 gg)

Conteggio e calcolo finale La capacità preservante di un prodotto è definita buona se: • • • < 10 microrganismi/ml al 7° giorno di incubazione Un valore * D < 4 h per i microrganismi patogeni Un valore D < 28 h per batteri non patogeni, muffe e lieviti Una significativa diminuzione della carica microbica nel tempo Un mancato aumento della carica * valore D: il tempo espresso in ore necessario ad abbattere di 1 logaritmo ovvero del 90% la carica microbica inoculata

Linear regression L’inoculo viene effettuato come un classico challenge test, ma la carica microbica viene valutata in tempi diversi ma più ravvicinati. Viene valutata la carica microbica residua per ogni ceppo fino a 24 h dall’inoculo. Il grosso vantaggio della metodica è legato alla rapidità di esecuzione e di risposta, che consentono in una settimana di dare giudizi predittivi sul sistema conservante. Repeat insult test Consiste nel ripetere più volte il challenge test per valutare ulteriormente la capacità preservante

In use test (test “in uso”) Permette di valutare la stabilità microbiologica di un prodotto cosmetico nelle normali condizioni d’uso da parte del consumatore, rappresentando quindi un vero e proprio “test in vivo”. Il modello sperimentale varia in funzione della tipologia di prodotto e di packaging che vengono valutati per ogni singolo caso. -Prevede un primo periodo di invecchiamento, con o senza utilizzo giornaliero, in camera termostatata per un periodo di tempo corrispondente al PAO presunto (l’utilizzo di una camera termostatata a 40°C per un mese, equivale a sei mesi di invecchiamento reale). -Segue un periodo di utilizzo giornaliero (in use effettivo) in camera termostatata per un periodo variabile in funzione delle caratteristiche del prodotto, del packaging e del PAO previsto. -Vengono infine effettuati controlli microbiologici a scadenze determinate per valutare la carica microbica totale e l’eventuale presenza di patogeni. La durata prevista per l’analisi, il numero di utilizzi giornaliero e il modo di utilizzo vengono valutati per ogni singolo prodotto.