OPTIKAI SPEKTROSZKPIA 2011 1 1 Fotodinamikus terpia VT

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2011 1. 1. Fotodinamikus terápia (VT), szept. 21. 1. 2. Fotokróm anyagok (BP), szept. 28. 1. 3. Fluoreszcencia-mikroszkópia (VT), okt. 5. 1. 4. Festékpróbák az anyagtudományban (KM), okt. 12. 1. 5. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM), okt. 19. 1

ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp 05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo 05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo 05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel 05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer 05) 2

Festékpróbák Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák 3

Reichardt’s dye 4

Reichardt’s dye „charge transfer” festék C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319 -2358 (1994) 5

A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz elegyben (GW), ionos folyadékban (IL), acetonitrilben (ACN) és diklórmetánban (DCM). K. A. Fletcher, Green Chem. 3, 210 -215 (2001) 6

Oldószer polaritás S 1 = 810 nm Ph-O-Ph = 453 nm H 2 O S 0 7

skála Az oldószer polaritását jellemzi. 8

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől 9

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban + 78 C max = 568 nm - 78 C max = 513 nm 10

Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban + 78 C max = 568 nm - 78 C max = 513 nm Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban 1 bar max = 547 nm 10 kbar max = 520 nm 11

Festékpróba CD-spektroszkópiai alkalmazása 12

Példa biológiai CD vizsgálatra: DNS vizsgálata akridin naranccsal AN Az AN interkalációs komplexet képez 13

AN – DNS rendszerek CD spektruma a hozzáadott DNS mennyiség függvényében exciton felhasadás D. Fornasiero, J. Phys. Chem. 85, 613 (1981) 14

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál 15

Fluoreszcens festékpróbák J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999 16

Oxazin 1 N C 2 H 5 O N + C 2 H 5 Cl. O 4 17

Oxazin 1 UV-látható abszorpciós spektruma Abszorbancia 2, 5 2 1, 5 1 0, 5 0 200 400 600 800 Hullámhossz (nm) 18

Oxazin 1 + receptor 19

20

Spektrofluoriméterek -stacionárius - időfelbontásos ( F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás) 21

Vázlat Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás Statikus kioltás dinamikus kioltás oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása Lippert-egyenlet vibrációs relaxáció Oldószer relaxáció kettős fluoreszcencia feherjék fluoreszcenciája / triptofán FRET rotációs diffúzió (orientációs relaxáció) 22

Stacionárius 23

Időkorrelált egyfoton-számlálás 24

Fluoreszcencia lecsengési görbe 25

Statikus kioltás 26

Oxazin 1 + receptor 27

28

29

30

Dinamikus kioltás 31

Lakowicz, p. 461 32

Lakowicz, p. 461 33

M + h M* M+ M+Q 34

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval 35

Stern-Volmer egyenlet 36

Oldószer polaritása és hőmérséklete 37

Oldószer polaritás S 1 S 0 38

S 1 vibrációs relaxáció 10 -12 s oldószer relaxáció 10 -10 s emisszió 10 -9 s abszorpció 10 -15 s S 0 oldószer relaxáció 39

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet ---+ G v. E _ ++++ 2 a 40

Lippert-egyenlet ---+ _ ++++ G v. E 2 a 41

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása Lakowicz, p. 191 42

Prodan Ikerionos gerjesztett állapot, spektrum eltolódás a polaritás függvényében Lakowicz, p. 200 43

Patman CH 3 CH 2 CH 3(CH 2)14 + CH 2 N(CH 3)3 C O A Prodan lipofilizált + ionos változata 44

Lakowicz, p. 199 45

IF Lakowicz, p. 199 400 500 [nm] -Oldószer relaxáció sebessége kisebb, ha csökken a hőm. - a sáv -30 C-on a legszélesebb: kettős fluoreszc. 46

Kettős fluoreszcencia DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201 47

Acrylodan H O H H 3 C N H CH 3 Hidrofób festék, zsírsav-megkötő fehérje vizsgálatára használják 48

Zsírsavkötő fehérje működésének vizsgálata Titrálás zsírsavval (oleát) Lakowicz, p. 202 FABP = fatty acid binding protein 49

Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán 50

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, p. H 7) Lakowicz, p. 446 51

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1) Apoazurin Pfl 2) T 1 ribonuklease Lakowicz p. 453 3) staphillococcus nuclease 4) glucagon 52

Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UVfénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2 -10 nm-es távolságok érzékelhetők 53

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával. 54

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos 55

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003) 56

Akceptor Donor: Et. Br (etidium bromid) 57

BODIPY fluoreszcencia Et. Br abszorpció 58

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni 59

60

Festékmolekula orientációs relaxációja ---+ G v. E _ ++++ 2 a 61

Hidrodinamikai súrlódás járuléka Stokes-Einstein-Debye egyenlet 62

Dielektromos súrlódás járuléka 63

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al. , (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366 -372 (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága ( ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát 64

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán 65