OPTIKAI SPEKTROSZKPIA 2015 1 Fluoreszcens jelzanyagok KM szept

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2015 1. Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept. 16. 2. Fotokróm anyagok (BP), szept. 23. 3. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), szept. 30. 4. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 7. 5. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 14. 7. Közeli infravörös spektroszkópia és mikroszkópia (GSz), okt. 21. 8. Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), okt. 28. 1

ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp 05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo 05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo 05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel 05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer 05) 2

Jablonski-diagram

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál 4

Fluoreszcens festékpróbák Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999 5

Vázlat Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása Polaritás szenzorok Viszkozitás szenzorok Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán Távolságmérés: FRET 6

Spektrofluoriméterek -stacionárius - időfelbontásos ( F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás) 7

Stacionárius 8

Gerjesztési és emissziós spektrum Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S 0 →S 1, S 0 →S 2, ∙∙∙ átmenetek sávjai Emissziós sp: csak S 1 →S 0, 9

Időkorrelált egyfoton-számlálás 10

Fluoreszcencia lecsengési görbe 11

Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása 12

Na+ indikátor Coro. Na Green 13

Na+ indikátor Na+ ionok eloszlása idegsejtben, mikroszkópos kép Coro. Na Green alkalmazásával, W. J. Tyler et al. , Plos. One 3, e 3511 (2008) 14

Na+ indikátor SBFI Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik Szelektív: a Na+ a K+ mellett is mérhető 15

Na+ indikátor SBFI-vel festett idegsejt 16

Klorid indikátor MQAE Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br-, I- igen Működése dinamikus kioltáson alapszik 17

Klorid indikátor Kloridion eloszlás idegsejtekben IF kép FLIM: fluorescence lifetime imaging 18

Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet M + h M* M+ M+Q 19

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval 20

Stern-Volmer egyenlet 21

Polaritás szenzorok nílus vörös water, - methanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6. acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tertbutylether - cyclohexane - toluene. 22

Szolvatoktromizmus: a szín függ az oldószertől 23

Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga Kim G H et al. J Cell Sci 2001; 114: 2009 -2014 24

Nile red staining of neutral and polar lipids in SAM-6 -induced apoptosis on tumor cells. Pohle T et al. Cancer Res 2004; 64: 3900 -3906 © 2004 by American Association for Cancer Research

„charge transfer (CT)” festékek S 1 S 0 Oldószer polaritás 26

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet ---+ G v. E _ ++++ 2 a 27

Lippert-egyenlet ---+ _ ++++ G v. E 2 a 28

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása etanol-víz oldószerelegy Lakowicz, p. 191 29

Viszkozitás szenzor 30

Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió) Stokes-Einstein-Debye egyenlet f alaktényező (gömbalakra f = 1) C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1) h környezet viszkozitása VM molekula térfogat T hőmérséklet k Boltzmann állandó 31

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al. , (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366 -372 (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága ( ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát 32

or mérése: a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük 33

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán 34

Kettős fluoreszcencia: twisted intramoleculat charge transfer = TICT DMANCN fl. színképe etilénglikolban, a két sáv int. aránya viszkozitásfüggő Lakowicz, p. 201 35

Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán 36

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, p. H 7) Lakowicz, p. 446 37

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1) Apoazurin Pfl 2) T 1 ribonuclease Lakowicz p. 453 3) staphillococcus nuclease 4) glucagon 38

Lakowicz, p. 461 39

Lakowicz, p. 461 40

Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UVfénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2 -10 nm-es távolságok érzékelhetők 41

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával. 42

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos 43

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003) 44

Akceptor Donor: Et. Br (etidium bromid) 45

BODIPY fluoreszcencia Et. Br abszorpció 46

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni 47