OPTIKAI SPEKTROSZKPIA 2017 1 Fluoreszcens jelzanyagok KM szept

OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2017 1. Fluoreszcens jelzőanyagok (KM), szept. 15. 2. Királis anyagok optikai spektroszkópiája (KM), szept. 29. 3. Fotodinámiás terápia (VT), okt. 6. 4. Fluoreszcenciás képalkotó eljárások (VT), okt. 13. 5. Fotokróm anyagok (BP), okt. 20. 6. Fémkomplexek lumineszcenciája (BP), okt. 27. 1

ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp 05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo 05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo 05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel 05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer 05) 2

Nobel prize in Chemistry 2008 GFP = Green Fluorescent Protein Martin Chalfie Osamu Simamura Roger Y. Tsien 3

Nobel prize in Chemistry 2014 STED = Stimulated Emission Depletion Eric Betzig Stefan W. Hell William E. Moerner 4

Jablonski-diagram

A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál 6

Fluoreszcens festékpróbák Cél: a mikrokörnyezet jellemzése a fluoreszcencia sáv J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2 nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999 7

Vázlat Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása Polaritás szenzorok Viszkozitás szenzorok Fehérjék fluoreszcenciája / triptofán Távolságmérés: FRET 8

Spektrofluoriméterek -stacionárius - időfelbontásos ( F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás) 9

Stacionárius 10

Gerjesztési és emissziós spektrum Gerjesztési sp: hasonlít az abszorpciósra, S 0 →S 1, S 0 →S 2, ∙∙∙ átmenetek sávjai Emissziós sp: csak S 1 →S 0, IF készülékfüggő! 11

Fluoreszcencia kvantumhatásfok F meghatározása - integráló gömbbel - standarddal X: minta R: standard IX, IR a fluoreszcenciasávok integrált intenzitása AX, AR abszorbanciák a gerjesztés hullámhosszán n. X, n. R törésmutatók 12

Időkorrelált egyfoton-számlálás 13

Fluoreszcencia lecsengési görbe IRF 14

Kémiai szenzorok: ionok, molekulák kimutatása 15

Na+ indikátor Coro. Na Green 16

Na+ indikátor Na+ ionok eloszlása idegsejtben, mikroszkópos kép Coro. Na Green alkalmazásával, W. J. Tyler et al. , Plos. One 3, e 3511 (2008) 17

Na+ indikátor SBFI Gerjesztési spektrumot mérnek, ott max eltolódik Szelektív: a Na+ a K+ mellett is mérhető SBFI = sodium-binding benzofuran isophthalate 18

Na+ indikátor SBFI-vel festett idegsejt 19

Klorid indikátor MQAE Szelektív: nitrát, foszfát nem oltják ki, Br-, I- igen Működése dinamikus kioltáson alapszik 20

Klorid indikátor Kloridion eloszlás idegsejtekben IF kép FLIM: fluorescence lifetime imaging 21

Dinamikus kioltás: Stern-Volmer egyenlet M + h M* M+ M+Q 22

A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval 23

Stern-Volmer egyenlet 24

Polaritás szenzorok nílus vörös water, - methanol - acetonitrile - dimethylformamide, 6. acetone - ethyl acetate - dichloromethane - n-hexane - methyl-tertbutylether - cyclohexane - toluene. 25

Szolvatoktromizmus: a szín függ az oldószertől 26

Algasejtből nyert lipid testecskék rendeződése A sejtmembrán sérülése után új sejtek képződnek A minta nílus vörössel festve: a membrán (lipid) sárga Kim G H et al. J Cell Sci 2001; 114: 2009 -2014 27

„charge transfer (CT)” festékek S 1 S 0 Oldószer polaritás 28

Polaritás hatása: Lippert-egyenlet ---+ G v. E _ ++++ 2 a 29

Lippert-egyenlet ---+ _ ++++ G v. E 2 a 30

Naftilamin-származékok Stokes eltolódása etanol-víz oldószerelegy Lakowicz, p. 191 31

Viszkozitás szenzor 32

Festékmolekula orientációs relaxációja (rotációs diffuzió) Stokes-Einstein-Debye egyenlet f alaktényező (gömbalakra f = 1) C súrlódási tényező (0<C<1, ha a részecske nagy az oldószermolekulákhoz képest C ~ 1) h környezet viszkozitása VM molekula térfogat T hőmérséklet k Boltzmann állandó 33

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al. , (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366 -372 (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága ( ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát 34

or mérése: a fluoreszcencia depolarizáció időfüggését mérjük 35

Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán 36

Kettős fluoreszcencia: twisted intramoleculat charge transfer = TICT DMANCN fl. színképe etilénglikolban, a két sáv int. aránya viszkozitásfüggő Lakowicz, p. 201 37

Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán 38

Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, p. H 7) Lakowicz, p. 446 39

A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1) Apoazurin Pfl 2) T 1 ribonuclease Lakowicz p. 453 3) staphillococcus nuclease 4) glucagon 40

Lakowicz, p. 461 41

Lakowicz, p. 461 42

Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UVfénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2 -10 nm-es távolságok érzékelhetők 43

Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával. 44

Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos 45

Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003) 46

Akceptor Donor: Et. Br (etidium bromid) 47

BODIPY fluoreszcencia Et. Br abszorpció 48

Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni 49